高效液相色谱法同时测定羊肉中的11种镇静剂类药物

魏晋梅，罗玉柱，*，白云旭

（1.甘肃农业大学研究测试中心，甘肃兰州730070；2.甘肃省草食动物生物技术重点实验室，甘肃兰州730070；3.甘肃农业大学理学院，甘肃兰州730070）

镇静剂（sedative）是指能使中枢神经系统产生轻度抑制，减弱机能活动，从而起到消除躁动不安、恢复安静的一类药物。近年来，个别畜牧业饲养者因经济利益的驱使，擅自在畜禽饲养过程中添加此类药物以起到镇静催眠、增重催肥、缩短出栏时间的作用；另外，在动物运输过程中，为减少动物死亡和体重下降，防止肉品质降低，也常使用此类药物以减少应激带来的损失[1]。非法使用此类药物会使其原形和代谢产物不可避免地残留于动物源食品中，人们食用了这些食品后，肝脏负担加重，头脑长期昏沉，记忆受影响，同时运动神经和肌肉功能受到抑制，因此许多国家都将此类药物列为禁用药物。我国农业部第193号公告规定严禁在动物饲料和饮用水中使用此类药物，在动物源食品中不得检出此类药物[2]。

目前，检测镇静剂类药物残留的方法主要有液相色谱-串联质谱法（LC-MS-MS）[3-9]、液相色谱法（HPLC）[10-11]、气相色谱-质谱联用法（GC-MS）[12-13]等。国标规定检测此类药物用液-质联用法[14-15]，但这种方法投资大、成本高，很多实验室条件不具备。本文建立了羊肉中11种镇静剂类药物残留量的液相色谱检测方法，该方法检测成本低、灵敏度高、回收率高，能满足大多数实验室检测的需求。

1 材料与方法

1.1 材料与仪器

羊肉样品 购自桃海市场（兰州）；对照品：唑吡坦（171258-200601）、氟哌啶醇（100313-200301）、氯氮卓（171248-200301）、氯丙嗪（100460-200501）、奋乃静（100133-200602）、氟奋乃静（100162-201003）、奥沙西泮（171229-201104）等 购自中国药品生物制品检定所；甲苯噻嗪（11010，纯度≥98.0%）、丙酰丙嗪（10404，纯度≥99.0%）、咔唑心安（00421，纯度≥99.0%）等 Dr.Ehrenstorfer公司标准品（德国）；氟哌利多（CDCU-1229001） USP标准品；甲醇 为色谱纯试剂，购自DIKMA公司（美国）；其他试剂 均为国产分析纯试剂。

Agilent1100 series液相色谱仪 配有二元泵、DAD检测器，美国Agilent公司；AB104-N电子天平 Mettler Toledo公司；RE-52C旋转蒸发器 郑州市亚荣仪器有限公司；SUPRA 22K高速离心机 韩国Hanil公司；KH3200B型超声波清洗器 功率150W，昆山禾创超声仪器有限公司。

1.2 实验方法

1.2.1 样品制备 取新鲜羊肉背最长肌100g，切碎后混合、均质，于-18℃冷冻保存、备用。

提取：取均质样品5.0g于50m L具塞离心管内，加入15m L 1%氨水-乙腈溶液，超声提取10m in，4000r/m in离心5m in，移出上清液，重复上述步骤2次，合并上清液。向上清液中加入5.0g NaCl，充分混合，静置5m in，移除上清液，于35℃减压浓缩至近干，加入1m L甲醇溶液，涡旋至瓶内残渣全部溶解下来，过0.22μm有机相滤膜后，进HPLC分析测定。

1.2.2 色谱条件 色谱柱：ZORBAX Eclipse Plus C18（250mm×4.6mm，5μm）；以甲醇（A）-0.1%甲酸（B）为流动相进行梯度洗脱（0～8min，90%B→55%B；8～13min，55%B→5%B；13～25min，5%B→90%B）；流速0.8m L/min；柱温25℃；检测波长245nm、254nm；自动进样器样品室温度25℃，进样量10μL。

1.2.3 标准溶液制备 分别准确称取唑吡坦、氟哌啶醇、氯氮卓、氯丙嗪、奋乃静、氟奋乃静、奥沙西泮、甲苯噻嗪、丙酰丙嗪、咔唑心安、氟哌利多等11种标准品10.00mg，用甲醇溶解，并定容至50m L的棕色容量瓶中，制成标准储备液。此储备液中11种标准品的浓度为200μg/m L。使用前用甲醇将此储备液稀释至所需浓度，配制成标准工作液和标准混合工作液。

2 结果与讨论

2.1 样品前处理条件优化

本实验尝试了分别用乙腈、甲醇、乙酸乙酯、0.1%氨水-乙腈、甲醇-乙酸乙酯（v/v，1∶1）等试剂对样品进行提取。甲醇、乙酸乙酯和甲醇-乙酸乙酯提取液在旋转蒸发浓缩时呈非常浑浊、粘稠状，用甲醇洗脱，经C18小柱净化后，溶液澄清，但放置过夜后溶液中有絮状物；乙腈和0.1%氨水-乙腈提取液较澄清，但乙腈提取液的回收率低。原因可能是氯氮卓、奥沙西泮属于苯二氮卓类药物，唑吡旦是咪唑并吡啶类药物，氯丙嗪是吩噻嗪类药物。苯二氮卓类药物具有类似的环状结构，且大多数呈中性或弱碱性，因此在弱的酸性或碱性条件下即可被有机溶剂提取出来。吩噻嗪类药物属于脂溶性药物，在碱性条件下易溶于有机溶剂。因此，本实验选用0.1%氨水-乙腈作为提取溶剂。另外，实验中用了HLB和C18小柱两种固相萃取柱对提取液进行净化，结果表明两种小柱的净化效果没有明显差异。

2.2 色谱条件的优化

分别用甲醇-0.1%甲酸、乙腈-0.1%甲酸作为流动相进行梯度洗脱。实验过程中发现乙腈-0.1%甲酸作为流动相时，有些药物同时出峰或出双肩峰，分离效果不好。甲醇-0.1%甲酸作为流动相进行梯度洗脱，11种药物都能很好地分离，便于定性、定量。在190～380nm进行波长扫描后发现，254nm时各药物都有很好的响应，但甲苯噻嗪、唑吡坦、咔唑心安、氟哌利多、氯氮卓、丙酰丙嗪、氟哌啶醇、奥沙西泮等8种药物在245nm的响应值更高，因此，选择254nm作为氯丙嗪、奋乃静、氟奋乃静3种药物的检测波长，其他8种药物的检测波长为245nm（图1）。

2.3 标准曲线的制备

用甲醇将标准储备液稀释成一系列不同浓度的标准工作液，依次进HPLC分析，以峰面积对浓度进行线性回归，得到11种镇静剂类药物的线性回归方程和相关系数（表1）。以信噪比（S/N）等于3为标准，测得11种镇静剂类药物的检出限（表1）。甲苯噻嗪、唑吡坦、咔唑心安、氟哌啶醇、氯氮卓、丙酰丙嗪、氯丙嗪、奋乃静、氟奋乃静在0.02～200μg/m L范围有良好的线性关系，奥沙西泮在0.005～200μg/m L范围有良好的线性关系，氟哌利多在0.05～200μg/m L范围有良好的线性关系。

表1 11种镇静剂类药物的线性回归方程及检出限Table1 Linear functions and detection limit of 11 sedatives

2.4 方法的回收率与精密度

在空白样品中加入标准工作液，按1.2.1方法制备样品，平行测定六次，将测得的峰面积代入回归方程，计算各镇静剂类药物的含量，并计算出平均加标回收率，结果见表2。11种药物的平均回收率在64.0%～121.3%，相对标准偏差小于20%。

图1 11种镇静剂类药物在选定色谱条件下的色谱图Fig.1 Chromatogram of 11 sedatives by HPLC

表2 方法的回收率和精密度Table2 Spiked recoveries and precision of 11 sedatives in blank samples

3 结论

本文建立了羊肉中11种镇静剂类药物的HPLC测定方法，以甲醇-0.1%甲酸为流动相进行梯度洗脱，采用245nm和254nm两个波长进行检测，11种药物得到了很好的分离和较强的吸收。该方法回收率高、精密度好，能够满足大多数实验室的检测需求。

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