多发性骨髓瘤中p15基因甲基化及其mRNA表达的研究

李灿美，杨 凌，刘 琳，李一辉，杨善兰，金美四，贺振新

（1．大理州人民医院 血液肿瘤科，云南 大理 671000；2．昆明医科大学第一附属医院 血液科，云南 昆明 650032；3．昆明医科大学第二附属医院 血液科，云南 昆明 650101）

多发性骨髓瘤（multiple myeloma,MM）是起源于B淋巴细胞的恶性克隆性疾病，其具体发病机制尚未阐明，常规化疗效果差，迫切需要探索其发病机制，寻找新的治疗途径。近年来国内外的大量研究均已证实DNA甲基化是血液肿瘤抑癌基因失活的常见机制。p15基因都是细胞周期蛋白依赖性激酶抑制剂（CDKI）家族的重要成员，是目前研究较多的抑癌基因。近十年来的文献报道中，MM患者p15基因甲基化的阳性率在1.8%～75%之间[1,2]。各家的结果很不一致。为了探讨p15基因甲基化与MM发生、发展及预后的关系，我们采用甲基化特异性聚合酶链反应（MSP） 研究MM中p15基因甲基化与其mRNA转录阻抑的关系，为该病的治疗提供一定的理论基础。

资料与方法

一、临床资料 选取2009年1月～2011年6月确诊的54例多发性骨髓瘤患者骨髓标本，标本来自昆明医学院第一附属医院血液科和第二附属医院血液科，其中男性35例，女性19例，年龄38～79岁，中位年龄64岁，平均年龄（63.44±8.94）岁，包括初诊患者27例，复发患者27例。Druie-Salmon分期：I期A组2例，II期A组16例，II期B组16例，III期A组19例，III期B组13例。所有病例诊断均符合标准[3]。对照组为非血液肿瘤患者骨髓标本（主要为营养不良性性贫血和免疫性血小板减少症患者），共40例。

二、试剂和仪器 DNA提取试剂盒，RNA提取试剂盒为杭州Axygen Bioscigens公司产品。EZ DNA Methylation-GoldTM Kit，Zymo Taq PreMix TM Kit为美国ZYMO Research公司产品。 TRIzol Reagent抽提液，Platinum SYBR Green qPCR SuperMix-UDGKit等购自美国Invitrogen公司。PCR扩增仪，qPCR扩增仪和全自动凝胶图像分析仪均为美国Bio-rad公司的产品。p15基因甲基化的引物序列（参照文献[4）]由上海invitrigen公司合成。qPCR引物采用primer3.0软件设计，产物长度控制在100-150bp，并用NCBI primer blast进行引物检测，确认为单一性产物。所有引物具体序列、产物长度及退火温度见附表。

三、DNA与RNA的提取 基因组DNA的提取、DNA亚硫酸氢盐修饰、修饰后模板的纯化按Herman[4]方法。RNA的提取采用杭州Axygen Bioscigens公司的RNA提取试剂盒，按试剂盒操作步骤提取，并用分光光度仪测定RAN浓度。

四、MSP法检测p15基因启动子区的甲基化状态 1．已修饰并纯化的DNA2μl，加入上下游引物各1μl，热启动酶Zymo Taq Pre Mix25μl，加入RNase-Free＆DNase-Free ddH2O21μl，构成总体积50μl的反应体系。在反应条件是95℃预变性10min，95℃变 性30s，58℃退 火30s，72℃延 伸30s，共35个循环，72℃链接7mim。最后进行结果判定，取PCR产物5μl，2%琼脂糖凝胶TBE电泳。电泳完毕后，取下凝胶，紫外线灯下观察结果。以DNA marker2000bp标准分子质量，泳动位置与预期片段长度相符的特异性产物判断为阳性，拍片记录。2．将MSP扩增产物50μl冰盒保存，送上海Invitrogen公司行全自动测序技术测序，测序结果运用DNAstar软件进行拼接，BiQAnalyzer软件进行比对分析。

五、RT-qPCR检测p15基因mRNA表达情况1．RT-qPCR反应体系，将提取的RNA用Easy Script First-Strand cDNA Synthesis SuperMix Kit将其逆转录为cDNA保存。取cDNA4μl，加入上下游引物 各1μl，Platinum SYBR Green qPCR Super-Mix-UDG 25μl，加 入RNase-Free＆DNase-Free ddH2O 19μl，构成总体积50μl的反应体系。在反应条件是50℃、95℃预变性各2mim，95℃变性15s，60℃退火30s，共40个循环，65-95℃溶解曲线1min下进行PCR反应。实验中以GAPDH作为内标基因，以标准化各个标本中p15基因相对表达量，以Hela及HEPG2为质控，以P15基因作为目的基因。2．结果判定标准，反应的数据由Bio-Rad CFX软件进行收集及分析。通过目的基因和内参基因拷贝数的比值进行样本间相对定量的比较。所有数值以相对于GAPDH基因升高或减少的倍数(Fold)表示。所有标本的基因复制的数值均以阈值循环(Cycle threshold Ct)表达[3]。具体如下：目的基因的表达量=2-△△Ct，△△Ct=(Ct目的基因-Ct内标基因)实验组-(Ct目的基因-Ct内标基因)对照组，表示的是实验组目的基因相对于对照组的变化倍数，使用这一方法可直接得到目的基因相对于内参基因组的定量[4]。

附表 引物序列及退火温度

六、统计学方法 甲基化情况分析采用四格表χ2检验，基因表达分析以中位数加减四分位数间距进行描述，两组间采用随机样本秩和检验统计分析，均以P≤0.05时有统计学差异（统计用SPSS17.0统计软件包）。

结 果

一、MM患者p15基因的甲基化状态 54例MM患者的MSP检测结果为：p15基因启动子区CpG岛甲基化阳性者有15例，甲基化率是27.778%，其检测结果通过电泳均可见到一条148bP的甲基化阳性PCR扩增产物，大多数同时伴有154bp的甲基化阴性PCR扩增产物（如图1所示）。其余的39例多发性骨髓瘤患者只检测到一条154bP的甲基化阴性PCR扩增产物。40例正常人及非累及骨髓的血液病患者仅检测到154bp的甲基化阴性PCR扩增产物，均无甲基化。MM患者p15基因的甲基化率与对照组比较差异有统计学意义（P＜0.05）。

二、p15基因CpG岛甲基化与多发性骨髓瘤某些临床特征之间的关系

1．根据病程阶段将所收集的多发性骨髓瘤患者分为初发及复发两组。结果为初发组27例中9例p15基因甲基化，阳性率为33.333%；而复发组27例中9例发现甲基化，阳性率22.22%。初发和复发两组多发性骨髓瘤患者P15基因CpG岛甲基化率呈逐渐降低趋势，初发组＞复发组。但统计学分析显示初发组患者的p15基因甲基化率虽然高于复发组，但无显著性差异(P>0.05)。

2．根据所收集资料将多发性骨髓瘤患者以65岁的年龄分为两组。结果为年龄≥65的组p15基因甲基化率为26.923%，而年龄＜65的组p15基因甲基化率28.571%对多发性骨髓瘤患者进行年龄分组对p15基因CpG岛甲基化率进行比较，统计学分析显示均无显著性差异(P>0.05)。

3．根据所收集资料我们将多发性骨髓瘤患者以性别分为两组。结果为男性的组p15基因甲基化率为26.923%，而女性组p15基因甲基化率28.571%。对多发性骨髓瘤患者进行性别分组对p15基因CpG岛甲基化率进行比较，统计学分析显示均无显著性差异(P>0.05)。

4．不同临床分期，分组间多发性骨髓瘤患者p15基因CpG岛甲基化状态。对I，Ⅱ及Ⅲ期多发性骨髓瘤患者p15基因CpG岛甲基化率进行比较，统计学分析显示均无显著性差异(P>0.05)。对A组和B组多发性骨髓瘤患者p15基因CpG岛甲基化率进行比较，统计学分析显示均无显著性差异(P>0.05)。

5．甲基化与非甲基化标本测序结果分析。将MSP扩增阳性及阴性标本进行测序，测序结果运用DNAstar软件进行拼接，测序结果用BIQanalyzer软件进行分析，比对分析分析具体甲基化位点。结果显示（见图2）：在p15基因启动子区5’端产物检测出19处碱基发生甲基化。

图1 MSP检测多发性骨髓瘤患者P15基因Cp G岛甲基化状态

图2 p15启动子区5'端甲基化与非甲基化序列比较图

6．p15基因甲基化与其mRNA表达结果分析。对实验数据进行正态性检验，偏度（Skewness，Sk）、峰度（Kutosis，Ku） 均＞0，提示实验数据呈正偏态分布。随后对实验组和对照组、甲基化组和非甲基化组进行Wilcoxon两样本秩和检验。P15基因在mRNA表达水平上，实验组：28.64±28.77Fold；对照组：25.79±78.16Fold，实验组与对照组之间比较，差异无统计学意义（P＞0.05）。甲基化组：28.64±19.13Fold；非甲基化组：29.86±29.24Fold；甲基化组与非甲基化组比较，差异无统计学意义（P＞0.05）；初诊组：23.92±26.46Fold；复发组：36.13±27.65 Fold；甲基化组与非甲基化组比较，差异无统计学意义（P＞0.05）。

讨 论

DNA甲基化是哺乳动物遗传外修饰的重要调控方式，在基因表达调控，基因结构的稳定等方面有重要作用。研究表明，DNA甲基化模式改变与肿瘤形成有密切关系[5]。p15基因（又名CDKN2B cyclin-dependent kinase inhibitor 2B，inhibits CDK4） 是定位于人类第9号染色体9p21上的抑癌基因，是细胞周期素依赖激酶抑制剂（CDKI） 家族的重要成员。p15基因抑制细胞周期素依赖激酶（CDK4/6） 的活性，阻止Rb（视网膜母细胞瘤蛋白） 基因磷酸化，抑制转录因子E2F解离，使细胞周期在G→S转换中停滞，导致细胞恶性转化。研究发现，多种血液系统恶性肿瘤都存在p15基因的甲基化失活现象，在各种类型的急性白血病、慢性髓细胞性白血病、前髓性白血病、成人淋巴细胞性白血病和淋巴瘤中都有p15基因启动子区的甲基化[6-7]；Martin等[8]发现p15基因的异常与浆细胞疾病有关，在多发性骨髓瘤中p15基因高甲基化是重要的事件。但Galm[1]等人的结论与之相反，他们在53例患者中仅发现1例p15基因启动子区的甲基化。

我们的研究显示，p15基因启动子区的异常甲基化比例明显高于对照组，表明p15基因异常甲基化可能在MM发生中为重要失活机制。电泳发现有甲基化等位基因(M)扩增的肿瘤标本中往往可见非甲基化等位基因(U)的同时扩增，考虑原因可能为多发性骨髓瘤细胞中混有正常细胞，难以排除正常DNA的干扰，在行MSP时非甲基化DNA和甲基化DNA的p15基因同时被扩增，或者肿瘤细胞中P15基因的两个等位基因有一个未发生甲基化之故，这两种原因在电泳中难以区分。所以，我们对MSP产物进行测序，其结果显示：在p15启动子区5’端产物检测出19处碱基位点发生甲基化。这表明p15启动子区异常甲基化是存在的。

我们试图寻找p15基因甲基化与MM临床特征和预后的关系。但研究表明，性别，年龄，I，Ⅱ及Ⅲ期和A，B组的多发性骨髓瘤患者的p15基因CpG岛甲基化率无统计学差异，与Esteban等的结论一致[9]。提示p15基因甲基化可能是多发性骨髓瘤发病中的一个早期作用环节。我们的研究表明，初发及复发两组多发性骨髓瘤患者p15基因CpG岛甲基化率呈降低趋势，尤其初发组甲基化率略高于和复发组，但统计上并无显著性差异(P>0.05)，这种降低趋势提示p15基因甲基化可能与多发性骨髓瘤患者的化疗反应有关，但这种推测有待于进一步增加样本量来证实，因为传统的化疗药物很少具有逆转甲基化的作用，因此该结论的可信性有待进一步论证。

虽然甲基化直接与基因的转录有关，但是遗传物质DNA到蛋白质经历转录、翻译特别是转录过程中所转录的mRNA的多少直接影响着相关最终蛋白质的多少。因此本研究采用RT-qPCR检测转录抑制状态来了解MM的进展程度，治疗效果及预后的判断。研究结果显示多发性骨髓瘤患者的骨髓液中p15基因mRNA的表达水平与对照组之间无统计学差异（P>0.05） ,甲基化组与非甲基化组，初诊与复发组亦无统计学差异（P>0.05）。提示尚不能根据p15基因mRNA的表达水平判断多发性骨髓瘤的病理分期、进展情况等。此结果不排除标本量不足产生的结果偏差，需加大标本量进一步研究。同时该研究结果与王明鸣等[10]报道的U266细胞株接近，提示甲基化并非唯一调控p15mRNA表达的因素，其翻译为蛋白的过程中还受到其他机制的调控。

总之，p15基因作为与细胞周期调控有关的重要抑癌基因，其甲基化的异常在多发性骨髓瘤中确实存在，MSP方法灵敏性高，因此使用MSP方法检测p15基因的甲基化状态将有可能成为检测MM微小残留病的一个指标[11]，去甲基化的药物可能是一种有效的治疗方法[12]。

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