川西北牦牛源产肠毒素大肠杆菌的分子流行病学调查

郝一妹, 张焕容,2, 张斌,2, 汤承

(1. 西南民族大学生命科学与技术学院, 四川 成都 610041; 2. 动物医学四川省高等学校重点实验室, 四川 成都 610041)

川西北牦牛源产肠毒素大肠杆菌的分子流行病学调查

郝一妹1, 张焕容1,2, 张斌1,2, 汤承1

(1. 西南民族大学生命科学与技术学院, 四川 成都 610041; 2. 动物医学四川省高等学校重点实验室, 四川 成都 610041)

为调查川西北地区牦牛源产肠毒素大肠杆菌的流行情况, 对采自川西北甘孜州和阿坝州的26份腹泻牦牛粪便样品进行大肠杆菌分离, 分别以分离的大肠杆菌DNA和牦牛腹泻粪便样本提取的总DNA为模板, 采用PCR方法扩增产肠毒素大肠杆菌黏附因子K99+菌毛基因片段, 分析产肠毒素大肠杆菌在牦牛腹泻中存在情况, 同时比较两种DNA提取方法对产肠毒素大肠杆菌PCR检出率的差异; 以分离自外表健康牦牛粪便的105株大肠杆菌DNA为模板, 采用PCR方法扩增产肠毒素大肠杆菌黏附因子K99+菌毛基因片段, 比较牦牛源产肠毒素大肠杆菌在外表健康牦牛和腹泻牦牛中的携带情况. 结果：从26份牦牛腹泻粪便样本中共鉴定出84个大肠杆菌菌落携带K99菌毛基因, 这些菌落分别来自所有26份牦牛腹泻样品, 因此, 牦牛腹泻样本100%分离并检测到携带K99+菌毛基因的产肠毒素大肠杆菌; 而粪便总DNA检测结果为K99+菌毛基因阳性率 84.62%(22/26), 粪便中提取的总DNA模板K99+菌毛基因PCR检出率略低于分离鉴定的细菌DNA检出率; 105株外表健康牦牛粪便样本分离株中检测到携带K99+菌毛基因的产肠毒素大肠杆菌34株, 检出率为32.38%(34/105), 产肠毒素大肠杆菌在牦牛腹泻样本中的检出率显著高于外表健康牦牛粪便的检出率(P<0.001). 结果表明, 产肠毒素大肠杆菌在牦牛粪便中存在广泛, 是引起牦牛腹泻的一种重要病原菌; 以粪便中提取的总DNA为模板, 可快速检测牦牛粪便中产肠毒素大肠杆菌的存在.

牦牛; 腹泻; 产肠毒素大肠杆菌; K99+菌毛基因

致病性大肠杆菌包括产志贺氏毒素大肠杆菌( Shiga toxin-producing Escherichia coli , STEC), 产肠毒素大肠杆菌(enterotoxigenic Escherichia coli, ETEC), 肠侵袭性大肠杆菌(enteroinvasive Escherichia coli, EIEC), 肠致病性大肠杆菌(enteropathogenic Escherichia coli, EPEC), 肠聚集性大肠杆菌(enteroaggregative Escherichia coli, EAEC)和弥散粘附型(diffusely adherent Escherichia coli, DAEC)[1]. ETEC是致人、畜腹泻最常见的大肠杆菌, 具有重要的公共卫生学意义[2]. 国内外学者一致认为ETEC能产生两种致病因子, 即黏附因子和肠毒素[3-4]. ETEC主要借助其所产生的菌毛抗原黏附于小肠粘膜, 定居并产生肠毒素而呈现致病作用[5]. 虽然大肠杆菌血清型很复杂, 但牛的ETEC一般都含有K99﹑F41﹑31A﹑FY(ATT25)等菌毛抗原, 其中以 K99﹑F41最为常见[6], 只要检测到携带K99菌毛基因的大肠杆菌, 即可判定该大肠杆菌为ETEC[7-8]. 世界多个国家对牛的产肠毒素大肠杆菌进行了深入的调查研究. 而牦牛作为青藏高原特色的物种之一, 对其含K99+菌毛基因产肠毒素大肠杆菌的携带情况未见文献报道. 本研究对川西北地区阿坝州和甘孜州腹泻牦牛的粪便总DNA和从腹泻粪便样品中分离的大肠杆菌提取的DNA, 以及外表健康牦牛粪便分离的大肠杆菌DNA进行ETEC黏附因子K99+菌毛基因PCR检测, 以弄清牦牛源产肠毒素大肠杆菌的流行情况, 为该病的防治提供理论, 并为该种致病菌的临床快速检测提供可靠的方法.

1 材料与方法

1.1 菌株和粪便样本

外表健康牦牛源大肠杆菌105株, 分离自川西北甘孜州和阿坝州来源的待屠宰牦牛粪便棉拭子, 由西南民族大学动物医学实验室保存[9]; 大肠杆菌 C83912, 购自国家兽医微生物菌种保藏中心; 16份来自甘孜州塔公草原和10份来自阿坝州若尔盖腹泻牦牛的新鲜粪便样本.

1.2 引物合成

参照文献[10]中引物序列合成产肠毒素大肠杆菌黏附因子K99+菌毛基因引物1对. 引物信息见表1, 引物由上海生工生物工程技术有限公司合成.

表1 引物信息Table 1 Information for primers

1.3 主要试剂

Taq DNA聚合酶、dNTP、DNA Marker 600均购自大连宝生物公司; 琼脂糖购自大连宝生物工程; 麦康凯琼脂培养基购自北京陆桥技术有限责任公司.

1.4 粪便样品的预处理[11]

每份粪便样本0.5g加入装有750μL无菌PBS缓冲液(0.05mol/L, pH7.4)的1.5 mL离心管中充分振荡摇匀5-10min后500rpm 离心5min, 取上清液. 此步骤重复3次. 上清液5 000rpm/min离心10min, 收集沉淀臵于1.5 mL离心管中. 沉淀物重悬于1mL双蒸水中.

1.5 粪便总DNA的提取

取上述粪便样品预处理液, 根据卢圣栋[12]改良的酚/氯仿抽提法提取总DNA 作为模板.

1.6 细菌的分离培养及DNA提取

将粪便棉拭子接种于含LB培养液中, 预增菌8 h, 接种环沾取一环用三分区逐步稀释划线接种于麦康凯培养基, 臵37℃培养24 h, 观察其菌落特征. 挑取特征菌落增菌后按酚-氯仿法提取细菌DNA.

1.7 产肠毒素大肠杆菌K99+菌毛基因PCR检测方法的建立

采用下述反应体系：10×PCR Buffer 2.5µL, dNTP10 mmol/L2µL, 上下游引物均为10 pmol/L各1µL, Taq酶5U/L 0.2µL, DNA模板2µL, 加超纯水至总体积25µL ; PCR反应条件为 95℃预变性5min, 94℃变性30s, 55℃退火40s, 72℃延伸50s, 共30个循环, 72℃延伸10min; 以参考菌株作为阳性对照, 灭菌超纯水作为空白对照,建立产肠毒素大肠杆菌K99+菌毛基因的PCR检测方法.

1.8 细菌DNA和粪便样品总DNA的PCR检测

采用1.7中建立的方法对105株分离自外表健康牦牛粪便的大肠杆菌DNA以及26份粪便样品中分离的93株大肠杆菌DNA和26份腹泻粪便总DNA进行PCR检测.

2 结果

2.1 产肠毒素大肠杆菌K99+菌毛基因PCR检测方法

以参考菌株作为阳性对照, 灭菌超纯水作为空白对照, 成功建立产肠毒素大肠杆菌K99+菌毛基因的PCR检测方法, 扩增产物经2%琼脂糖凝胶电泳分析, 获得了约200bp的特异性条带, 经测序证实目的片段大小为230bp.

2.2 腹泻粪便样品中分离细菌的K99+菌毛基因PCR检测结果

从26份腹泻粪便样品中共挑取93个可疑菌落, 菌落增菌后提取DNA经PCR检测, 其中84个菌落来源的DNA检测出K99+菌毛基因片段, 而这84个菌落分属于26份腹泻粪便样品, 随机抽取PCR产物测序证实为

230bp的目的基因. 因此, 经细菌分离后, 腹泻样品中100%检测到K99+菌毛基因.

2.3 腹泻粪便样品总DNA K99+菌毛基因PCR检测结果

26份腹泻样品总DNA中, 有22份获得了与预期目的片段大小相符的特异性条带, 随机抽取PCR产物测序证实为230bp的目的基因片段, 26份腹泻样品总DNA中K99+菌毛基因阳性检出率为84.62%(22/26).

2.4 外表健康牦牛源大肠杆菌DNA K99+菌毛基因PCR检测结果

105株外表健康牦牛源大肠杆菌DNA经PCR检测, 其中34株的DNA经PCR扩增获得了特异性条带, 阳性检出率为32.38%(34/105), 随机抽取PCR产物测序证实为230bp的目的基因片段. 部分样品的 PCR扩增结果如下图1.

图1 腹泻牦牛粪便样本部分菌株K99基因PCR扩增结果M:DNA MarkerII，N：阴性对照，P：阳性对照，1～12: 不同菌株K99基因PCR扩增扩增结果

3 讨论

牦牛是分布在海拔3000米以上的古老牛种之一. 中国有1400多万头, 是世界上拥有牦牛数量和品种最多的国家, 约占世界牦牛总数的95%以上[13]. 牦牛对高寒草地生态环境条件具有很强的适应性, 能在空气稀薄、牧草生长期短、气候寒冷的恶劣环境条件下生活自如, 繁衍后代, 并为牧民提供奶、肉、毛、役力、燃料等生产、生活必需品, 是当地畜牧业经济中不可缺少的畜种. 牦牛腹泻症是目前危害牛业生产的主要疾病之一. 临床上以排水样、糊状或褐色粪便为特征[14], 给牦牛业带来了重大的经济损失. 本试验对外表健康牦牛粪便中分离的105株大肠杆菌经K99+菌毛基因PCR扩增鉴定, 发现其中34株携带K99+菌毛基因, 阳性率高达32.38%(34/105),而腹泻样本经直接提取粪便总DNA和经细菌分离培养后PCR 检测, K99+菌毛基因检出率分别为84.62%(22/26)和100%(26/26). 可见从外表健康牦牛粪便中分离的大肠杆菌K99+菌毛基因携带率明显低于临床腹泻牦牛粪便样品总DNA 和经分离鉴定的大肠杆菌中提取的DNA检出率. 推测携带K99+菌毛基因的产肠毒素大肠杆菌是引发川西北牦牛腹泻的重要原因之一. 本试验针对牦牛腹泻样本, 分别采取了粪便总DNA和分离细菌的DNA作为PCR检测模板, 粪便总DNA检出率略低于分离细菌的DNA检出率, 但两种DNA PCR检测结果差异不显著, 直接提取粪便总DNA作为PCR检测模板大大缩短了检测时间, 人力和材料消耗少, 能够达到快速检测的目的; 而先分离细菌再检测, 耗时长, 工作量大, 但检测结果更准确.

[1] MUDIT CHANDRA,PUI CHENG,GAELLE RONDEAU,et al. A single step multiplex PCR for identfication of six diarrheagenic E.coli pathotypes and Salmonella[J]. International Journal of Medical Microbiology, 2013(303): 210-216.

[2] RANIAA NADA,ADAMARMSTRONG,HINDI SHAHEEN,et al.Phenotypicand genotypic characterization of enterotoxigenic Escherichia coli isolated from U.S. military personnel participating in Operation Bright Star, Egypt, from 2005 to 2009[J]. Diagnostic Microbiology and Infectious Disease, 2013(76): 272-277.

[3] STEPHEN D. Enterotoxigenic Escherichia coli infections in newborn calves:a review[J]. J Dairy Sci, 1985(68):229-256.

[4] WRAY.Aspects of coli bacillosis in farm animals[J]. J Hyg, 1985(75): 577-593.

[5] 张勇, 吴鹏, 张天聪, 等. 牛源大肠杆菌分离株菌体抗原及菌毛特性研究[J]. 黑龙江八一农垦大学学报, 2007, 19(3): 76-80.

[6] SHIMIZU M, T SAKANO, J YAMAMOTO,et al. Incidence and some characteristics of fimbriac FY and 31A of Escherickia coli isolates from calves with diarrhea in Japan[J]. Microbio Immunol, 1987(31): 417-426.

[7] 段新华,李建军. 致犊牛腹泻肠毒素大肠杆菌多重 PCR检测方法的建立[J]. 中国动物检疫, 2010, 27(1): 33-34.

[8] CLEIDE FERREIRA CATANI,TATSUMI YAMADA,MARILDA C. Vidotto, Tomomasa Yano, Adhesion of bovine enterotoxigenic Escherichia coli(ETEC) by type l-like fimbriae[J]. FEMS Microbiology Letters, 1996(137): 241-245.

[9] 宋定州,于学辉,汤承,等.牦牛产志贺毒素大肠杆菌主要黏附因子相关基因的分子流行病学调查[J]. 中国畜牧兽医, 2013, 40(1): 153-156.

[10] YONG-IL CHO,WON-IL KIM. Development of a panel of multiplex real-time polymerase chain reaction assays for simultaneous detection of major agent-s causing calf diarrhea in feces[J]. J Vet Diagn Invest, 2010(22):509-517.

[11] 陈蓓, 黄瑞. 粪便标本中细菌DNA提取方法的比较[J]. 中国血液流变学杂志,2007, 17(2):210-214.

[12] 卢圣栋. 现代分子生物学实验技术[M]. 2版, 北京: 中国协和医科大学出社, 1999: 61-149.

[13] 中国畜禽遗传资源状况编委会.中国畜禽遗传资源状况[M]. 北京: 中国农业出版社, 2004.

[14] 陈明勇, 陈德成, 曾群辉, 等. 西藏地区牦牛致病性大肠杆菌的分离鉴定[J]. 中国预防兽医学报, 2001, 23(5): 389-390.

Investigation of enterotoxigenic escherichia coli isolated from yak in northwest Sichuan Province

HAO Yi-mei, ZHANG Huan-rong, ZHANG Bin, TANG Cheng
(1. School of Life Science and Technology, Southwest University for Nationalities, Chengdu 610041, P.R.C.;
2. Key Laboratory of Sichuan Institutes of Higher Learning, Chengdu 610041, P.R.C.)

In order to investigate the enterotoxigenicEscherichia coli(ETEC) in yaks distributed in northwest Sichuan province,Escherichia coli(E. Coli.) is isolated from diarrhea or healthy-looking yak fecal samples collected from Ganzi and Aba prefectures in Northwest Sichuan province, and then total DNA extracted from diarrhea fecal samples or isolatedE. Coli.DNA is used as template in PCR to amplify ETEC K99+gene. ETEC K99+gene positive rate is 84.62% (22/26) in the 26 yak diarrhea fecal sample total DNA, and 84E.Coli.colonies isolated from 26 yak diarrhea fecal samples are identified as ETEC carrying K99+gene distributing in all 26 yak diarrhea fecal samples; 34 strains of ETEC containing K99+gene are identified in 105E.Colistrains isolated from healthy-looking yak fecal samples, theE. Coli.K99+gene positive rate is 32.38% (34/105). The results show that ETEC exists in both yak diarrhea feces and healthy-looking yak feces, which is a major pathogen in yak diarrhea disease; total DNA extracted from diarrhea fecal samples can be used to rapidly identify ETEC in yak feces.

S852.61, S858.23

A

1003-4271(2014)01-0016-04

10.3969/j.issn.1003-4271.2014.01.03

2013-08-17

汤承(1963-), 男, 教授, 博士, E-mail:Tangcheng101@163.com.

西南民族大学研究生创新课题(CX2013SZ67); 国家“十二五”科技支撑计划课题(2012BAD13B06).