超临界CO2流体萃取啤酒糟中色素工艺的研究

姜福佳，吕 爽，逯家富

（长春职业技术学院，吉林长春130033）

随着社会发展的不断进步，人们越来越重视健康，天然、绿色食品逐渐被人们青睐，啤酒糟中的色素是一种天然色素，可以作为食品和许多生活用品中的着色剂，并且具有很强的生理活性[1-2]。

啤酒糟是啤酒工业的副产品，其中含有丰富的粗蛋白和色素，营养价值较高。目前，啤酒糟多用来添加到动物的饲料中，没有使啤酒糟的综合利用价值得到充分的提高。因此，我们以啤酒糟为原料，提取其中的色素具有重大意义[3-7]。

超临界流体萃取是一种新型的提取分离技术，它是利用压力和温度对超临界流体溶解能力的影响而对物质进行提取。在超临界状态下，将超临界流体与待分离的物质接触，使其有选择性地按极性大小、沸点高低和分子量大小依次将成分萃取出来。然后借助减压、升温的方法使超临界流体变成普通气体，被萃取物质则完全或基本析出，从而达到分离提纯的目的，所以超临界流体萃取过程是由萃取和分离组合而成，从多种液态或固态混合物中萃取出待分离的组分[8-9]。由于响应面分析法精确度高、优化效果好[10]，所以，本研究用超临界CO2流体萃取法提取色素，在单因素实验的基础上，将响应面法应用于超临界CO2流体萃取色素的工艺优化，以提高色素的含量。

1 材料与方法

1.1 材料与仪器

啤酒糟 烘干、粉碎（80目）华润雪花啤酒长春有限公司；原花色素 河北百味生物科技有限公司；CO2液化气 纯度99.9%以上，长春巨洋氧气厂；无水乙醇（分析醇） 天津市富宇精细化工有限公司；

鼓风干燥箱 河北黄骅航天仪器厂；多功能粉碎机 上海广沙工贸有限公司；A221-50-06型CO2超临界萃取装置 江苏南通华安超临界有限公司；UV-2401 PC型紫外可见分光光度计 岛津公司；721型紫外分光光度计 上海精密科学仪器有限公司；

1.2 实验方法

1.2.1 单因素实验

1.2.1.1 萃取温度对色素含量的影响 称取啤酒糟100g，装入萃取釜中，在萃取温度分别为25、30、35、40、45、50、55℃的条件下，按萃取压力30MPa（分离Ⅰ、分离Ⅱ温度和压力分别为30℃、9MPa和30℃、6MPa），CO2流量为25L/h萃取啤酒糟90m in，收集色素，测定吸光度，计算色素含量。

1.2.1.2 萃取压力对色素含量的影响 称取啤酒糟100g，装入萃取釜中，在萃取温度40℃，萃取压力分别为10、15、20、25、30、35MPa（分离Ⅰ、分离Ⅱ温度和压力分别为30℃、9MPa和30℃、6MPa），CO2流量为25L/h的条件下萃取啤酒糟90min，收集色素，测定吸光度，计算色素含量。

1.2.1.3 CO2流量对色素含量的影响 称取啤酒糟100g，装入萃取釜中，在萃取温度40℃，萃取压力30MPa（分离Ⅰ、分离Ⅱ温度和压力分别为30℃、9MPa和30℃、6MPa），CO2流量分别为10、15、20、25、30、35、40L/h的条件下萃取啤酒糟90min，收集色素，测定吸光度，计算色素含量。

1.2.1.4 萃取时间对色素含量的影响 称取啤酒糟100g，装入萃取釜中，在萃取温度40℃，萃取压力30MPa（分离Ⅰ、分离Ⅱ温度和压力分别为30℃、9MPa和30℃、6MPa），CO2流量25L/h的条件下，分别对啤酒糟萃取60、90、120、150、180、210m in，收集色素，测定吸光度，计算色素含量。

1.2.2 啤酒糟色素提取物的紫外-可见分析图谱 将实验所提取的色素稀释，在紫外可见光区波长200～ 800nm下进行检测，结果显示，物质在280nm下有最大吸收峰，说明物质中含原花色素的某些成分。色素提取物的紫外分析图谱见图1。

图1 色素提取物的紫外分析图谱Fig.1 The pigmentextractuvmap analysis

图2 标准曲线Fig.2 The standard curve

1.2.3 标准曲线的制作 称取10mg原花色素，配制成0.1mg/m L浓度的标准溶液，分别吸取1、2、3、4、5、6m L，在10m L的棕色容量瓶中定容，所得色素的浓度分别是0.01、0.02、0.03、0.04、0.05、0.06mg／m L。放入冰箱中平衡0.5h，用无水乙醇作为空白液，用紫外分光光度计在280nm处测其吸光度值。结果用最小二乘法做线性回归，得标准曲线图，见图2。得到的标准曲线方程为：

式中：A—吸光度值；X—原花色素的浓度（mg/m L）。

1.2.4 色素含量的测定 超临界CO2流体萃取出啤酒糟中的色素后，将萃取物离心分离，分离除去脂肪等杂质，得到色素。吸取色素50μL，定容至5m L，在280nm下测定吸光度，计算色素含量[11]。

色素含量（μg/g）=C280×V×稀释倍数/E×M

式中：C280—为色素在280吸光度下的浓度（mg/m L）；V—为样品溶液的总体积（m L）；E—为色素在无水乙醇中百分消光系数，2348；M—啤酒糟质量（g）。

1.2.5 响应面法优化色素提取的最佳工艺方法 本实验针对影响超临界萃取效果的主要因素——萃取温度、萃取压力、CO2流量以及萃取时间进行单因素实验，在单因素实验的基础上，确定最佳的萃取时间，然后利用三因素三水平响应面分析方法对啤酒糟中色素的提取条件进行优化。依据最佳提取条件进行验证实验。响应面分析因素与水平见表1。

表1 响应面分析因素与水平Table1 Factors and levels of RSM analysis

2 结果与讨论

2.2 单因素实验

2.2.1 萃取温度对色素含量的影响结果 实验结果如图3所示。由图3我们可以看出，萃取温度对色素含量的影响显著，啤酒糟中的色素含量随着萃取温度的升高而逐渐上升，当萃取温度为45℃时达到最大，之后色素含量随温度的升高逐渐下降，这应该是因为，在一定压力下，温度升高，CO2密度降低，溶解能力下降[12]。因此，本实验所得的最佳萃取温度是45℃。

图3 萃取温度对色素含量的影响Fig.3 Effectof content temperature on pigment production rate

2.1.2 萃取压力对色素含量的影响结果 实验结果如图4所示，由图4我们可以看出，随着萃取压力的增加，色素的含量逐渐增大，当压力为30MPa时，色素的含量最高，当萃取压力高于30MPa后，色素的含量有所下降，这应该是因为，温度一定时，压力增大，超临界流体密度增大，对溶质的溶解能力越大，萃取趋于完全。当压力增至一定程度时，CO2溶解能力增加缓慢，色素的收率增加不大甚至降低[11]，因此，本实验中最佳萃取压力为30MPa。

图4 萃取压力对色素含量的影响Fig.4 Effect of content pressure on pigment production rate

2.1.3 CO2流量对色素含量的影响结果 实验结果如图5所示。由图5我们可以看出，随着CO2流量的升高，色素含量逐渐增大，当CO2流量为30L/h时，色素含量最高，然后随着CO2流量的继续升高，色素的含量有所下降，主要是由于CO2流量的增加提高了传质速率，增大萃取能力，提高了萃取效率，从而缩短萃取时间。萃取后期，由于萃取对象中待分离组分含量减少，故萃取量又降低。同时，CO2流量过大会导致CO2停留时间过短，反而使色素含量降低[13]，因此，通过实验，我们确定最佳CO2流量是30L/h。

图5 CO2流量对色素含量的影响Fig.5 Effect of CO2 flow rate on pigment production rate

2.1.4 萃取时间对色素含量的影响结果 实验结果如图6所示。由图6我们可以看出，随着萃取时间的延长，色素的含量逐渐增大，当萃取时间为150min时，色素的含量最高，随着萃取时间的继续增加，色素含量的增加幅度减小，近于平衡[14]，因此，最佳的萃取时间为150m in。

2.2 响应面法优化色素提取的最佳工艺结果

在单因素实验的基础上，我们确定最佳萃取时间为定量150min，以萃取温度、萃取压力、CO2流量三个因素作为自变量，以色素含量为响应值，设计三因素三水平的分析实验。实验设计方案及实验结果见表2。

图6 萃取时间对色素含量的影响Fig.6 Effectof content time on pigment production rate

表2 响应面分析方案及实验结果Table2 The experiment design and results of RSM

采用多元二次回归方程拟合实验结果，再用F检验统计分析工具和响应面图研究考察因子之间的交互关系及因子与响应值间的关系。最后采用导数求极值法求得色素提取的最优条件。

对表2中数据进行回归分析，获得色素含量对编码自变量萃取温度、萃取压力和CO2流量的二次多项回归方程：

回归分析结果见表3，其响应面图见图7。通过SAS软件对实验数据的分析，得R2为97.81%，说明回归方程可以较好地描述考察因子与响应值之间的关系。根据p值可以看出，萃取温度对色素含量的影响高度显著，失拟项不显著（p＞0.05），一次项X1、X2、X3，二次项X、X1X2、X、X均显著，说明它们对响应值影响较大。根据F值，我们可以判断影响色素含量大小的顺序依次为：萃取温度＞萃取压力＞CO2流量。

表3 回归分析结果Table3 The results of regression analysis

图7 （a）Y=f（X1，X2），（b）Y=f（X1，X3）和（c）Y=f（X2，X3）的响应面图Fig.7 Responsive surface graphs of（a）Y=f（X1，X2），（b）Y=f（X，X）and（c）Y=f（X，X）

图7直观地描绘出影响因素间交互作用的响应面曲面图。由图7响应面的最高点和等高线我们可以看出，在所选的范围存在极值，即响应面的最高点与等高线的中心点重合，图7（a）表明，X1和X2交互作用显著，X1较大的同时X2减小，Y值便会减小，即萃取温度升高，萃取压力降低，导致色素的含量降低，这可能是由于溫度升高后，CO2密度降低，溶解能力下降，压力同时减小，所以色素的含量降低。SAS软件系统给出了能够得到最大响应值的X1、X2、X3分别为X1= 46.3、X2=30.7、X3=29.5。即当萃取温度46.3℃，萃取压力30.7MPa，CO2流量为29.5L/h时色素含量最高，为67.2μg/g。

2.3 验证实验

我们进一步修改了响应面优化所得的最佳工艺参数，修整为萃取温度45℃，萃取压力30MPa，CO2流量30L/h，做三组平行的超临界CO2萃取实验，三组平行实验的色素含量分别是66.3、64.8、66.7μg/g，平均含量为65.9μg/g，与理论值的相对误差为1.9%，因此，模型能较好地预测色素的含量。

3 结论

本研究在单因素实验的基础上，利用响应面法优化影响色素含量的三种因素：萃取温度、萃取压力和CO2流量，通过回归分析，我们得到萃取温度对色素含量的影响高度显著，同时，通过多元二次回归方程得出最优的提取条件，即萃取温度45℃，萃取压力30MPa，CO2流量30L/h，最终所得啤酒糟中色素含量为65.9μg/g。本次实验，我们不仅得到了色素，同时除去了干啤酒糟中所含有的大量脂肪，为进一步提取蛋白质等活性物质奠定了基础。

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