山桃稠李果实花色苷对Nrf2/Keap1通路的影响

刘 荣，姜元松，辛 越，王 蕾，杨巍巍

（东北林业大学，黑龙江哈尔滨150040）

山桃稠李（Padus maackii）为蔷薇科稠李属的三种植物，在我国南北部地区均有分布生长，是多年生的落叶乔木[1]。我国学者在此植物的种植技术等方面研究颇多，而对其果实的花色苷抗氧化机制的研究利用未见报道。

本实验以山桃稠李果实花色苷作为抗氧化酶的诱导物，探究花色苷作用于HepG2细胞后，抗氧化系统的分子机制。从mRNA水平上分析花色苷对HepG2细胞的GSTP1、Nrf2、Keap1的基因表达的影响，探讨PI3K-Nrf2/Keap1信号通路在HepG2细胞抗氧化机制中的作用，以期为今后研究山桃稠李果实花色苷提供理论依据。

目前研究发现，调控抗氧化酶的表达的途径较多，其中诱导物对Nrf2/Keap信号通路的调控的途径研究的比较明确[2-3]。在正常状态下，Nrf2/Keap1复合物被控制在胞浆中，当受到诱导物的诱导后，Nrf2从Nrf2/Keap1复合物上解偶联释放，进入核内与ARE相互作用，促进抗氧化酶基因的转录。并且研究表明，磷酯酰肌醇-3-激酶（phosph oinositol-3-kinase，PI3K）能够激活Nrf2使其进入细胞核，并引起抗氧化基因表达上调[4]。

1 材料与方法

1.1 材料与仪器

肝癌HepG2细胞 哈医大肿瘤医院馈赠；山桃稠李 哈尔滨双环园林采摘；小牛血清 杭州四季青产品；噻唑蓝（MTT）、二甲基亚砜（DMSO） Sigma进口分装；改良型RPM I 1640培养基 赛默飞世尔生物化学制品有限公司；胰蛋白酶（2×105U/g） Sigma公司；双抗试剂（100U/m L青霉素、100μg/m L链霉素）北京索莱宝试剂公司；磷酯酰肌醇-3-激酶（PI3K）、焦炭酸二己醋（DEPC） Sigma公司；Trizol氯仿、总RNA提取试剂盒 北京赛百盛基因技术有限公司；RT-PCR试剂盒 宝生物工程（大连）有限公司；2000bPDNALadder 宝生物工程有限公司。

DF-110型电子分析天平 中国轻工业机械总公司；GL-16G-C型高速冷冻离心机 上海科兴仪器有限公司；低温冰箱 美国FORMA公司；酶标仪 美国Biocell公司；CO2培养箱 Thermo Forma公司；倒置显微镜 Nikon公司；ABI PRISM 7500型荧光定量PCR扩增仪 App lied Biosystems公司。

1.2 实验方法

1.2.1 花色苷的制备 分别取山桃稠李果实适量剪枝，榨汁，同pH=2的酸化乙醇按照料液比1∶4（W∶V）混合，提取2次，每次提取12h，合并提取液，旋转蒸发除去乙醇后，经X-5大孔树脂上柱纯化，减压浓缩，真空冷冻干燥得到山桃稠李果实花色苷粉末，-20℃保存。实验时将山桃稠李果实花色苷用PBS缓冲液稀释到一定浓度，0.22μm滤膜过膜备用[5]。

1.2.2 细胞的复苏与培养 从液氮中取出冻存的HepG2细胞迅速放入37℃水浴1m in，并不断摇动使其解冻。1000r/m in离心5m in，吸取上清液，培养于改良型RPMI 1640培养基中加入l00U/m L青霉素，100μg/m L链霉素以及10%的灭活胎牛血清的培养液中。将细胞置于37℃，5%CO2培养箱中培养，HepG2细胞在细胞培养瓶贴壁生长，每种培养液培养细胞均大于3次，每3～4d传代一次。

1.2.3 MTT法检测HepG2细胞生长抑制率 参照文献[6]，取对数生长期的HepG2细胞，经胰酶消化后，调整细胞密度为1×105Cell/m L，接种于96孔培养板，每孔100μL，将未经处理的细胞作为对照组，质量浓度为0.05、0.2、0.8mg/m L的花色苷的细胞作为处理组，只加花色苷和培养液而不含细胞的为空白组。其中处理组、对照组及空白组每个浓度各设3个复孔。培养24、48、72h后，每孔加入10μL MTT，继续培养4h，弃上清液，每孔加入150μL DMSO，利用酶标仪在490nm测A值，并计算细胞的生长抑制率。公式如下：

细胞生长抑制率（%）=[1-（处理组A值-空白组A值）/（对照组A值-空白组A值）]×100

1.2.4 细胞内GSH含量与GSH-ST、PI3K活性的测定

参照文献[7]的作法并有所改进，取对数生长期的细胞105Cell/m L均匀铺于24孔板，待细胞贴壁生长后更换培养液，实验组加入质量浓度为0.05、0.2、0.8mg/m L的山桃稠李果实花色苷的培养液，对照组加入正常的细胞培养液。在37℃，5%CO2培养箱中继续培养48h后，弃培养液，PBS清洗两遍，胰酶消化，1000r/m in离心5m in后收集细胞，细胞裂解液裂解细胞，离心后得细胞上清液，取适量进行蛋白质含量测定。按试剂盒说明进行操作，测定GSH含量与GSH-ST、PI3K活性。

1.2.5 山桃稠李花色苷对Nrf2/Keap1的基因表达的影响 实时荧光定量RT-PCR实验方法检测山桃稠李果实苷对HepG2细胞的Nrf2、Keap1、GSTP1的基因表达的影响。Gene Bank中找到Nrf2、Keap1、GSTP1基因序列，并利用加拿大Prem ier公司的Primer primer 5.0引物设计软件进行引物的设计，委托博仕生物公司进行合成。采用Trizol法提取细胞总RNA，紫外分光光度计测定总RNA的含量与纯度，反应条件设置为预变性温度95℃时间10min，变性温度95℃时间15s，退火温度60℃时间30s，延伸温度72℃时间30s，循环40次，缓慢升温的温度60～95℃，产生溶解曲线。

所有样本重复检测3次，每次均设空白对照，以GAPDH作内参基因。反应结束后，使用ABI PRISM 7500型荧光定量PCR扩增仪检测样品中目标基因的含量，以2-ΔΔCT作为目的基因的表达量，2-ΔΔCT表示处理组的目的基因相对于对照组原始模板浓度的倍数差异。

1.3 数据分析

作图采用Origin 8.0软件，统计学处理实验数据采用SPSS 13.0统计软件，One-Way ANOVA进行处理和显著性分析检验，在p＞0.05水平上差异不显著；在p＜0.05水平上差异显著。

2 结果与分析

2.1 山桃稠李果实花色苷对HepG2细胞增殖抑制结果

山桃稠李果实花色苷作用HepG2细胞24、48、72h后，结果如表1所示。随着花色苷浓度的升高以及作用时间的延长，对HepG2细胞增殖的抑制作用都逐渐增强，并呈浓度依赖与时间依赖。与对照组（未经处理的细胞）相比差异显著（p＜0.05），并且在同一时间点各浓度之间，同一浓度各时间点之间，山桃稠李果实花色苷对HepG2细胞的抑制率均有显著差异（p＜0.05）。当质量浓度为0.8mg/m L山桃稠李果实花色苷处理HepG2细胞24、48、72h后，抑制率分别为30.79%±2.38%、47.77%±3.61%、54.11%±3.47%。

表1 MTT法检测山桃稠李果实花色苷对HepG2细胞抑制率Table1 Inhibition of the anthocyanin extracted from Prunusmaackii on the proliferation of HepG2 cell tested by MIT

2.2 细胞内GSH含量与GSH-ST、PI3K活性的测定结果

山桃稠李果实花色苷作用于HepG2细胞48h后，由表2可知，随山桃稠李花色苷质量浓度的增大，GSH的含量与对照组相比逐渐减少，且呈一定的量效关系，质量浓度为0.05mg/m L山桃稠李花色苷与对照组相比差异显著（p＜0.05），且当质量浓度大于0.2mg/m L时，HepG2细胞内GSH的含量与对照组相比差异极显著（p＜0.01）。细胞内GSH-ST的活性出现下降趋势，即随着花色苷质量浓度的增大，GSH-ST的活性逐渐降低：当质量浓度为0.05mg/m L时，山桃稠李与对照组的差异显著（p＜0.05）；当质量浓度大于0.2mg/m L时，与对照组的差异极显著（p＜0.01）。而在检测PI3K活性时发现处理组的OD值虽均大于对照组，但却随着三种果实花色苷质量浓度的升高PI3K激酶的活性在逐渐降低，且各浓度与对照组比差异极显著（p＜0.01），呈量效关系。

表2 山桃稠李花色苷对HepG2细胞内GSH含量及GSH-ST、PI3K激酶活性的影响Table2 Effectof anthocyanins extracted from Prunusmaackii on the contentof GSH and activity of GSH-ST、PI3K in the HepG2 cells

2.3 山桃稠李花色苷对Nrf2、Keap1、GSTP1的基因表达的影响

2.3.1 山桃稠李花色苷对GSTP1的基因表达的影响采用实时荧光定量RT-PCR法，深入探讨稠李属果实花色苷对GSTP1 mRNA在HepG2细胞中的表达的影响。结果如图1所示，山桃稠李果实花色苷作用于HepG2细胞48h后，GSTP1 mRNA的表达与对照组相比较均下调，且随花色苷质量浓度的增大而逐渐降低。与对照组相比较GSTP1 mRNA的表达水平极显著降低（p＜0.01），说明山桃稠李果实花色苷影响了HepG2细胞中GSTP1的转录因子的表达，从而下调了HepG2细胞的抗氧化酶的表达。

2.3.2 山桃稠李花色苷对Nrf2的基因表达的影响

本实验同时探讨了稠李属果实花色苷对PI3K-Keap1/ Nrf2通路的影响，检测了山桃稠李果实花色苷作用HepG2细胞48h后，Nrf2 mRNA在细胞中的表达情况。结果见图1，山桃稠李果实花色苷作用于HepG2细胞48h后，Nrf2 mRNA的表达均随花色苷质量浓度的增大而逐渐降低。与对照组相比较Nrf2 mRNA的表达水平极显著降低（p＜0.01），说明由于花色苷的作用，PI3K激酶活力的下降，抗氧化系统受到破坏，影响了Nrf2与Keap1解离。

2.3.3 山桃稠李花色苷对Keap1的基因表达的影响

为进一步探究稠李属果实花色苷对PI3K-Keap1/Nrf2通路的影响，检测了山桃稠李果实花色苷作用HepG2细胞48h后，Keap1 mRNA在细胞中的表达情况。结果如图1所示，在花色苷的质量浓度为0.05mg/m L时，山桃稠李与对照组比较差异不显著（p＞0.05）。在花色苷的质量浓度增加到0.2mg/m L时，山桃稠李与对照组相比Nrf2 mRNA的表达水平均极显著降低（p＜0.01）。并且，山桃稠李果实花色苷作用于HepG2细胞48h后，Keap1的基因表达均随花色苷质量浓度的增大而下调。说明由于花色苷的作用，使得Nrf2与Keap1的基因表达量均有所减少。

图1 山桃稠李花色苷对Nrf2、Keap1、GSTP1的基因表达的影响Fig1 Effectof anthocyanins extracted from Prunusmaackii on Nrf2、Keap1、GSTP1 in genetic expression

3 结论与讨论

GSTP1属于谷胱甘肽转移酶系（GSTs），存在于胎盘和肺脏中，是重要的解毒酶。能够保护正常细胞免有毒化合物的攻击，分解代谢有毒物质，若抑制GSTP1的活性则可增强DNA损伤的敏感性。GSTP1在HepG2等肿瘤细胞组织中易表达调控，具有紧密的关系且大量存在[8]。

在细胞内调节抗氧化反应的一个重要的核转录因子为Nrf2，正常状态下，与Keap1结合，同时被一些活性酶类降解，使细胞内部处于动态平衡状态。但当Nrf2受外界因子及自身蛋白激酶（PKC）的影响而激活后，Nrf2与Keap1解离后进入细胞核内，影响抗氧化酶的表达[9]。

由山桃果实花色苷对HepG2细胞抗氧化系统的影响实验结果[10]可知，细胞内抗氧化酶GSH-ST的活性随着花色苷质量浓度的增大而逐渐降低，细胞内GSH的含量也随着花色苷质量浓度的增大而逐渐减少，即GSH-ST活性以及GSH的含量均出现下降的趋势。花色苷可引起HepG2细胞内PI3K激酶活性的降低，而PI3K途径参与了Nrf2/Keap1激活及其基因表达的调控。所以当PI3K激酶活性的降低时，Nrf2、Keap1的mRNA的表达受到抑制，使得Nrf2、Keap1的含量降低，Nrf2与抗氧化反应原件结合减小，导致抗氧化酶GSTP1mRNA的表达下调。而山桃稠李果实花色苷可通过降低胞内抗氧化酶活性而增加HepG2细胞内的ROS含量，ROS又会直接攻击抗氧化酶，迫使细胞内氧化应激压力增加导致细胞过氧化损伤，甚至凋亡。

近些年，Keap1/Nrf2信号通路成为抗氧化机制研究的热点[11-14]。但机体的抗氧化机制依然存在许多无法解释说明的问题，仍需要更深入的研究。

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