双组份SO2-ClO2保鲜剂对红提葡萄采后软化相关酶的影响

张玉丽，郭 芹，彭新媛，王吉德，吴忠红，潘 俨，吴 斌，*

（1.新疆农业科学院农产品贮藏加工研究所，新疆乌鲁木齐830091；2.中国农业科学院农产品加工研究所，北京100094；3.新疆大学化学化工学院，新疆乌鲁木齐830046）

果实的形成是果实生命的开始，历经生长和发育直至成熟，伴随着成熟而来是衰老及软化[1]。软化是果实成熟的一个重要标志，除了使果实的外观品质发生变化外，还削弱了果实抵抗周围不良因素的能力，致使果实的耐藏性和抗病性下降，缩短贮藏期及货架期。通常认为，果实的软化是由于细胞中胶层（果胶物质）结构的改变，引起细胞分离和细胞壁物质降解所造成的细胞壁总体结构的破坏[2-4]。果实的软化与细胞壁降解酶的活性密切相关，尤其是多聚半乳糖醛酸酶和纤维素酶，同时也受果胶甲酯酶、果胶裂解酶和β-半乳糖苷酶等细胞壁降解酶活性的影响[5-7]。

果实软化问题一直以来倍受生理学家及园艺学家的关注[8-9]。因此，研究与果实软化相关的细胞壁降解酶，将有利于找出影响果实软化的关键因子，为果实软化调控、延长贮藏期提供理论依据。

前期工作表明本实验室自制双组份SO2-ClO2保鲜剂先后释放出SO2和ClO2两种保鲜气体，其可有效保持红提葡萄的贮藏保鲜效果，延长葡萄的货架期。本文将进一步研究双组份SO2-ClO2保鲜剂对红提葡萄采后软化酶的影响，以期从果实生理学的角度探究双组份SO2-ClO2延缓果实衰老和软化的机理，为双组份SO2-ClO2在采后贮藏中的应用及开发符合绿色食品规范的葡萄保鲜贮运技术提供坚实的理论依据。

1 材料与方法

1.1 材料与仪器

双组份SO2-ClO2保鲜剂 采用亚硫酸盐释放出SO2气体还原氯酸盐产生ClO2气体的发生方法制备双组份保鲜剂。将焦亚硫酸盐、亚硫酸盐、次氯酸钠、氯化钠分别研细至100目备用，按SO2发生剂（A）与ClO2发生剂（B）质量比例为10/1，加入和丰膨润土、硅藻土及无机盐添加剂，混合至均匀，采用热压胶合制备成葡萄保鲜纸；N-三（羟甲基）甲基甘氨酸（Tricine）、半胱氨酰（cysteine）、聚乙烯吡咯烷酮（PVP）、聚乙二醇辛基苯基醚（Triton X-100）、乙二胺四乙酸（EDTA）、果胶、氢氧化钠、氯化钠、百里香溴酚蓝、醋酸钠、冰醋酸、多聚半乳糖醛酸（PGA）、β-巯基乙醇、3，5-二硝基水杨酸（DNS）、D-（+）半乳糖醛酸、咔唑、酒石酸钾钠、结晶酚、亚硫酸钠、羟甲基纤维素钠（CMC）、碳酸钠等 均为分析纯。

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1.2 葡萄样品的处理

红提葡萄 采自新疆昌吉三平农场，采收时选取大小和成熟度一致、无病虫害和机械损伤的果实，采摘后每筐按照发泡网，吸潮纸，供试葡萄7kg的顺序进行装框。框内待供试品采摘当天入库，敞口预冷24h后，分别加入吸潮纸和保鲜纸（对照样品只加吸潮纸，处理试样分别加双组份SO2-ClO2和单组份SO2，每种处理各设置6个平行筐），再放入厚度为0.03mm葡萄保鲜专用袋，扎口绳密封后置于（0±1）℃，RH 80%的条件下贮藏。每隔10d定期取样，取样时将果皮和果肉剥离，迅速用液氮冷冻，置于-80℃的超低温冰箱中备用。

1.3 果胶含量的测定

1.3.1 试剂配制 取无水乙醇1000m L，加4g锌粉及4m L浓硫酸溶液（1+1），恒温水浴回流10h，馏出液加锌粉和KOH（以每1000m L各加4g），重复蒸馏1次；取纯咔唑0.15g，用上述精制乙醇溶解并定容至100m L；取100mg半乳糖醛酸，溶解后定容至100m L，并以此为母液分别配制浓度为10～70μg/m L的半乳糖醛酸标准液。

1.3.2 标准曲线的绘制 参考张小玲的方法[10]，分别取具塞试管8支，依次加入浓硫酸12m L，置于冰水中依次缓慢加入0～70μg/m L的半乳糖醛酸标准溶液2m L，充分混匀。于沸水浴中加热10min，迅速用流动水冷却至室温，各管再依次加入咔唑乙醇溶液1m L，混合均匀后室温放置30m in充分反应。以0号管为对照，于530nm下测定吸光度值。以半乳糖醛酸含量为横坐标，对应吸光度值为纵坐标，绘制标准曲线。

1.3.3 样品测定

1.3.3.1 样品前处理 参考游新侠等[11]方法，将样品研碎过60目筛，分别取5～10g于烧杯中，加入70%的热乙醇，充分搅拌以提取其中的糖类，过滤，反复操作直至滤液不呈糖类反应（苯酚-硫酸法检测）。残渣依次用99%乙醇和乙醚洗涤，之后风干乙醚。

1.3.3.2 果胶提取 a.水溶性果胶提取：用150m L水将上述漏斗中残渣移入250m L烧杯中，加热至沸并持续沸腾1h，随时补充蒸发的水分，冷却后移入250m L容量瓶中，加水定容，摇匀后过滤（布式漏斗抽滤，弃去初滤液），收集滤液即为水溶性果胶提取液。b.总果胶提取：用150m L HCl（0.05mol/L，加热至沸）将漏斗中的残渣转入烧瓶中，于沸水中加热回流1h，冷却后转移至锥形瓶中，加2～3滴甲基红指示剂，用0.5mol/L NaOH滴定中和后，用水定容至250m L容量瓶中，摇匀后过滤，滤液即为总果胶的提取。

1.3.3.3 测定 取适当浓度的果胶提取液2m L（提取液用水稀释，含半乳糖醛酸10～70μg/m L），按制作标准曲线的方法操作，根据吸光度值对应标准曲线计算半乳糖醛酸浓度（μg/m L）。

1.3.3.4 样品中果胶的质量分数计算

式中，X—样品中果胶的质量分数（以半乳糖醛酸计），%；V—果胶提取液的总体积，m L；K—提取液的稀释倍数，本实验K=10；C—标准曲线计算的半乳糖醛酸浓度，μg/m L；m—样品质量，g。

1.4 果胶甲酯酶（PME）活性的测定

参照Pathak等的方法[12]。将冷冻葡萄样品研磨成粉，准确称取1.0g，加入4m L预冷的0.05mol/L醋酸钠缓冲液（pH 7.0，内含6.8%NaCl、1.8mmol/L EDTA），充分浸提20～30m in，12000r/m in 4℃下离心20m in，上清液用于酶活性的测定。反应体系中依次加入2m L 0.01%的果胶溶液（pH 7.5，用0.1mol/L NaOH溶液调节），0.4m L NaCl（0.15mol/L），0.2m L 0.01%的百里香溴酚蓝指示剂，0.4m L的双蒸水和0.2m L的酶液，混匀后迅速比色，于620nm波长下测定OD值的变化，OD620每分钟变化0.001为一个酶活力单位（U），酶活性以U·g-1·FW表示，每个处理平行测定3次。

1.5 多聚半乳糖醛酸酶（PG）活性的测定

参照Barreit等[13]的方法。将冷冻葡萄样品研磨成粉，准确称取1.0g，加入4m L预冷的0.1mol/L Tris-HCl缓冲溶液（pH 7.5，内含1mmol/L EDTA，0.7m L 10mmol/L β-巯基乙醇），充分浸提20～30min，12000r/m in 4℃下离心20min，取上清液为待测粗酶液。反应体系中依次加入0.2m L 0.2mol/L醋酸钠缓冲溶液（pH 4.5），0.3m L 1%PGA（多聚半乳糖醛酸）溶液，0.1m L酶提取液和0.4m L H2O。反应体系经37℃水浴60m in后加入1m L DNS（3，5-二硝基水杨酸）终止反应，于沸水中显色5m in，加双蒸水定容至10m L，摇匀后于540nm处测吸光值。以37℃时单位重量鲜果在单位时间内分解果胶产生1μg的游离半乳糖醛酸为一个果胶酶活性单位（U），每个处理平行测定3次。

1.6 果胶裂解酶（PL）活性的测定

参照Baldwin等[14]的方法。将冷冻葡萄样品研磨成粉，准确称取1.0g，加4m L预冷的20mmol/L Tris-HCl缓冲液（pH7.0，内含0.02mmol/L cysteine-HCl、0.02mmol/L EDTA和0.05%Triton X-100），12000r/m in 4℃条件下离心20m in，上清液为待测粗酶液。反应体系中依次加入1m L 4mmol/L醋酸钠缓冲溶液（pH 4.5）、1.5m L 1%PGA（pH4.5）和0.5m L酶提取液。反应体系经37℃水浴30m in后沸水浴2m in，摇匀后于235nm处测吸光度值，以37℃时单位重量鲜果在单位时间内分解果胶产生1μg的游离半乳糖醛酸为一个酶活性单位（U），每个处理平行测定3次。

1.7 纤维素酶（Cx）活性的测定

参照Lohani的方法[15]。将冷冻葡萄样品研磨成粉，准确称取1.0g，加4m L预冷的0.05mol/L的醋酸钠缓冲液（pH4.5，内含7.5g/100m L NaCl和0.5g/L PVP），充分浸提20～30m in，12000r/m in 4℃下离心20m in，上清液为待测粗酶液。取1m L酶液，40℃预热3m in后，加入2m L CMC（羟甲基纤维素钠作底物）。于40℃水浴60min后加入1m L DNS终止反应，立即放入沸水中显色5m in，用冰水冷却，以双蒸水定容至10m L，混匀后于540nm处测吸光值。以40℃时每分钟每克样品分解羟基甲纤维素钠产生1μg的葡萄糖为1个纤维素酶活力单位（U），每个处理平行测定3次。

1.8 β-半乳糖苷酶（β-Gal）活性的测定

参照Kluck等[16]的方法，稍作改动。将冷冻葡萄样品研磨成粉，准确称取1.0g，加4m L预冷的0.05mmol/L醋酸钠缓冲液（pH4.5，内含100mmol/L NaCl，1%的β-巯基乙醇），充分浸提20～30m in，12000r/m in 4℃下离心20m in，取上清液为待测粗酶液。反应体系依次加入0.1m L酶液，2m L 3mmol/L 4-硝基苯基-β-D-吡喃半乳糖苷（以pH4.7的0.05mmol/L醋酸钠缓冲液配制），40℃恒温水浴60m in，然后加入2m L 1mol/L Na2CO3溶液终止反应，于400nm处测吸光值。对照为不保温直接加入Na2CO3溶液。以40℃时每分钟每克鲜样释放1μg的硝基苯酚为一个酶活力单位（U），每个处理平行测定3次。

1.9 数据分析

使用SPSS 18.0对数据进行统计分析，Sigma Plot 10.0软件作图。各项指标的测得值均以平均值±标准误（S.E.）表示。

2 结果与分析

2.1 双组份SO2-ClO2对果胶含量的影响

果胶存在于一切高等植物中[4]，沉积在初生细胞壁与细胞间层，在初生壁中和不同含量的纤维素、半纤维素、木质素及一些伸展蛋白相互交联，从而使各种细胞组织结构坚硬，表现出其固有的形态，果实中总果胶含量越高，果实硬度就越大。

图1和图2为贮藏期内葡萄果实中果胶物质含量的变化趋势。由图1和图2可知，随着贮藏时间的延长，红提葡萄果实细胞壁的构成成分相应发生变化，果实内总果胶含量逐渐减少，水溶性果胶增加。不同处理的果实，总果胶变化呈现逐渐下降的趋势，其中以对照下降速度最快，至50d时由最初的2.08%变化为0.63%，而经双组份处理的果实，其下降速度较为缓慢，变化量仅为对照果实的71.84%。总果胶的降解增大了细胞壁的网络孔径，导致细胞壁膨胀，增加酶对底物的接触，从而加速了细胞的解体过程，最终导致果实软化。水溶性果胶含量则随着贮藏时间的延长逐渐增加，保鲜纸处理的果实其增加速度相对缓慢，以双组份SO2-ClO2效果最佳，至贮藏期50d时变化量为1.74%，仅为对照的75%。与对照相比，保鲜纸处理可以减少总果胶物质的分解，延缓可溶性果胶增加的速度，从而可抑制半乳糖醛酸和阿拉伯糖从细胞壁中分解，对细胞壁的结构完整起保护性作用。

图1 不同处理对果实原果胶的影响Fig.1 Effectof different treatmenton contentof total pectin in Red Globe grape

图2 不同处理对果实可溶性果胶的影响Fig.2 Effectof different treatmenton contentof soluble pectin in Red Globe grape

2.2 双组份SO2-ClO2对果实PME活性的影响

果胶酯酶（PME）广泛的存在于高等植物中，并以多种形式分布在植物组织内，可去除果胶分子链上半乳糖醛酸羧基上的酯化基团（主要为羟甲基或羟乙基），使高度甲酯化的糖醛酸残基形成多聚半乳糖醛酸及甲醇，催化果胶酯酸转化为果胶酸，形成PG作用的底物，从而PME被认为与果实的软化启动相关[6]。

图3为贮藏期内不同处理对果实内PME活性变化的影响，从图3可知，PME活性呈现持续上升的趋势，以对照上升速度最快，贮藏期结束时为最初活性的5倍之多，PME活性上升将导致细胞壁果胶物质甲酯化的程度呈降低趋势，进而转变成水溶性的果胶，因此加速了果胶水解及果实软化。而保鲜纸处理在一定程度上抑制了葡萄果实PME活性上升的速度，由此可减缓果实软化的速度，且两种保鲜纸处理无显著差异（p＞0.05），与对照存在显著差异（p＜0.05）。

图3 不同处理对果实PME活性的影响Fig.3 Effectof different treatmenton PME activity in Red Globe grape

2.3 双组份SO2-ClO2对果实PG活性的影响

多聚半乳糖醛酸酶（PG）是一类重要的水解酶，主要功能为催化细胞壁果胶酸1，4-2-D-半乳糖苷键的裂解，生成低聚的半乳糖醛酸或半乳糖醛酸，致使细胞壁解体，果实软化[17-19]。按PG对底物的作用方式不同可将其分为3种：a.内切多聚半乳糖醛酸酶（endo-PG，以内切方式随机从分子中间切断多聚半乳糖醛酸链）；b.外切多聚半乳糖醛酸酶（exo-PG）；c.寡聚半乳糖醛酸酶（oligo-PG）。后两者则以一种外切方式有顺序地从半乳糖醛酸多聚链或寡聚链的非还原端释放出1个单体或1个二聚体，产生半乳糖醛酸[20]。

图4 不同处理对果实PG活性的影响Fig.4 Effect of different treatment on PG activity in Red Globe grape

图4为贮藏期红提葡萄果实内PG活性的变化趋势图。由图4可知，对照果实PG活性急剧上升，至贮藏期50d时增至31.94U·g-1·FW，为初期的3倍之多。单组份SO2处理在贮藏初期上升速度较快，第20d增至15.9U·g-1·FW，随后则增加的较为缓慢。双组份SO2-ClO2处理对PG活性的抑制作用较为明显，整个过程上升了1倍，显著低于对照和单组份SO2保鲜纸处理（p＜0.05），由此可以说明，双组份SO2-ClO2可对PG活性有抑制作用，减缓原果胶向可溶性果胶转化的速度，从而减轻对细胞壁结构的破坏，延缓果实软化的速度。

2.4 双组份SO2-ClO2对果实PL活性的影响

果胶裂解酶（PL）是细胞壁重要的水解酶之一，它只能水解靠近甲酯基的α-1，4-糖苷键，反应遵循β-消除代替水解断裂，在非还原末端的C4和C5位置生成有不饱和键的半乳糖醛酸，而在还原性末端则与PG水解的情况相同，即在分解效果的表观上PL与PG是一样的，都可使还原糖含量增高和粘度降低[3]。

由图5可知，不同处理红提葡萄果实内PL活性呈现先上升后下降的趋势，其中以对照上升幅度最大，在第30d峰值为91.7U·g-1·FW，随后急剧下降。保鲜纸处理在一定程度上可以抑制PL酶活性上升的速度，减缓对细胞壁的伤害，但单组份SO2保鲜纸处理对PL酶活的抑制作用比双组份SO2-ClO2的显著（p＜0.05），其中的作用机理还有待于研究。

图5 不同处理对果实PL活性的影响Fig.5 Effectof different treatmenton PL activity in Red Globe grape

2.5 双组份SO2-ClO2对果实Cx活性的影响

纤维素酶（Cx）是一种细胞壁水解酶，在细胞壁降解过程中起着重要作用，该酶能够分解含β-1，4-糖苷键的半纤维素，但其却不作用于非水溶性纤维素[21]。纤维素酶能对羧甲基纤维素、木葡聚糖及具有葡聚糖结构的物质表现出活性，故又称为葡聚糖酶[22-23]。Cx主要存在于成熟的果实中，在未成熟的果实中其活性很低或几乎检测不到，且许多研究认为它与果实早期成熟的软化启动有着紧密的联系。

图6 不同处理对果实Cx活性的影响Fig.6 Effectof different treatmenton Cx activity in Red Globe grape

图6为贮藏过程中不同处理对红提葡萄果实中Cx酶活性变化的影响，由图6可知在整个贮藏期内，Cx活性呈现逐渐上升的趋势，以对照上升最快，双组份SO2-ClO2上升速度最为缓慢。至贮藏期50d时，对照活性可达到31.47U·g-1·FW，其活性为双组份SO2-ClO2处理果实的2倍。由此表明SO2-ClO2保鲜纸处理可以抑制Cx酶活性的上升速度，减轻细胞壁物质降解所引起的细胞壁总体结构的破坏，从而可延缓果实的软化。

2.6 双组份SO2-ClO2对果实β-Gal活性的影响

β-半乳糖苷酶主要作用于属李半乳聚糖骨架支链的残基，降解果胶的聚合体，破坏细胞壁的结构完整性。研究表明β-半乳糖苷酶在果实软化的早期含量最为丰富，其能降解果胶物质中的半乳聚糖，使半乳糖和阿拉伯残基从细胞壁中分解，攻击细胞壁的完整性[24]。该酶即使在无果胶酶作用时也可使细胞壁丧失原有的特性，活化的β-半乳糖苷酶也能帮助纤维素酶完成果实的软化。

图7 不同处理对果实β-Gal活性的影响Fig.7 Effectof different treatmentonβ-Gal activity in Red Globe grape

图7为贮藏期葡萄果实内β-Gal活性的变化趋势，由图7可知，在贮藏前40d内β-Gal呈现先上升后下降的趋势，之后其活性变化不大。不同处理间以对照上升的速度最快，在第20d达到峰值8.15U·g-1·FW，随后活性直线下降，且维持在较低水平。经保鲜纸处理的葡萄果实，其活性上升得到抑制，至贮藏期30d时双组份SO2-ClO2为6.71U·g-1·FW，单组份SO2为6.39U·g-1·FW，显著低于对照果（p＜0.05），且峰值出现的时间推迟了10d，可对维持细胞壁完整性起保护作用。

2.7 葡萄果实贮藏中细胞壁软化酶活性和果胶含量的相关性分析

对红提葡萄果实对照样品中果胶与细胞壁软化酶进行相关性分析可知（表1）：总果胶（TP）与水溶性果胶（WSP）、PG、Cx存在显著负相关性，也与PME存在极显著的负相关性；WSP与PME、Cx存在显著正相关性，同时与PG存在极显著正相关性，表明PME、Cx、PG协同作用于细胞壁，可促进总果胶向水溶性果胶的转化。PG与PME、Cx、WSP存在极显著正相关性，与TP呈现显著负相关性，说明红提葡萄果实在贮藏期间细胞壁软化酶和果胶是相互关联的，在果实软化过程中起着至关重要的作用。因此我们推测双组份SO2-ClO2处理可直接抑制PG、PME、Cx的活性来减缓果胶的水解，降低果实细胞壁的降解而进一步延缓果实的软化。

2.8 葡萄果实贮藏中细胞壁软化酶活性和果胶含量的回归分析

对红提葡萄果实对照样品进行回归分析可知（表2）：回归方程是准确的。回归分析进一步表明：总果胶（TP）与PME呈现显著性负相关，说明TP的含量与PME的活性相关，PME能催化、水解果胶生成果胶酸和甲醇，增加总果胶在水中的溶解度；水溶性果胶（WSP）与PG为显著正相关，但未得到PL与果胶的回归方程，表明细胞壁的软化被PME、PG直接调控。PG活性的增加有助于WSP含量的积累，从而加速细胞的解体过程。因此推测SO2-ClO2可通过抑制红提葡萄果实中PG、PME等细胞壁软化酶的活性，减缓原果胶向水溶性果胶的转换，降低果胶的水解速度，较好的保持细胞壁的完整性，从而保持果实的硬度。

3 讨论

表1 葡萄果实中果胶和细胞壁软化酶的相关分析Table1 The correlation analysis between pectin and cellwall enzyme activities

表2 葡萄果实细胞壁软化酶和果胶的回归分析Table2 The regression analysis between cellwall enzyme activities and pectin

果实的成熟软化是一个非常复杂的过程，其间经历了一系列生理生化的变化，包括细胞壁的降解，内含物的变化等。许多研究表明SO2和ClO2单独处理能使果实在贮藏期保持较高的硬度，维持果实品质，如葡萄、枇杷、桃等[25-27]。因此可更深入地研究SO2和ClO2结合处理对果实软化影响的机理。果实的细胞壁主要成分是果胶、纤维素、半纤维素和蛋白质。其果胶物质有三种形态：原果胶、果胶及果胶酸。原果胶不具水溶性，成熟果实质地的坚硬程度与原果胶含量相关。随着果实的衰老，总果胶被分解为果胶，果胶进一步被分解为果胶酸，造成细胞间的连接变得松弛，果实硬度下降。果胶及果胶酸的胶粘能力差，使细胞间的结合力变小，果实质地变软。在果实成熟过程中，PG酶与果实软化密切相关，果实的成熟软化伴随着PG酶活性提高和果胶的降解。PME能催化、水解果胶生成果胶酸和甲醇，通过去除果胶分子链上的半乳糖醛酸羧基上的酯化基团，增加果胶在水中的溶解度。研究表明SO2和SO2-ClO2处理减缓了PG酶活增加的速度，还抑制了PG的最大酶活性。PG的作用底物是多聚半乳糖醛酸（果胶酸），而果胶中多聚半乳糖醛酸残基通常是被甲氧基化的，要使PG有效地起作用，首先必须有果胶甲酯酶（PME）使果胶脱去甲氧基。因此，果胶的水解是在PG和PME协同作用下完成的[20]。SO2和SO2-ClO2处理均抑制了红提葡萄贮藏过程中果实内PG、PME和PL的活性，从而延缓了葡萄果实的软化速度。纤维素是细胞壁的骨架物质，果实在成熟软化过程中伴随着纤维素的降解。Cx可将纤维素水解为低分子糖类，导致果实细胞壁的降解，果实软化。在果实成熟的过程中，细胞壁发生的重要变化就是细胞壁多聚物中半乳糖残基的降解。本研究的结果表明，SO2和SO2-ClO2处理能抑制果实Cx和β-半乳糖苷酶活性的增加，延缓果胶和纤维素的降解，保持果实硬度。

4 结论

红提葡萄果实的成熟软化与果胶质的降解密切相关，果胶质的降解过程除了受果胶软化酶的直接调控外，纤维素酶对其也有重要影响。双组份SO2-ClO2保鲜纸可抑制果实内原果胶（TP）的水解，减缓可溶性果胶（WSP）的增加，延缓果实硬度的降低；同时可抑制果胶甲酯酶（PME）、多聚半乳糖醛酸酶（PG）、果胶裂解酶（PL）、纤维素酶（Cx）和β-半乳糖苷酶（β-Gal）等几种细胞壁软化相关酶的活性的增加，从而可延缓果胶和纤维素的降解，较好保持葡萄果实的硬度，延长红提葡萄果实的货架期。

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