两种游离DNA检测方法的比较研究*

施 维，戚 菁，申娴娟，吴信华，鞠少卿，刘才旺

（南通大学附属医院外科综合实验室，江苏226001）

·论著与基础研究·

两种游离DNA检测方法的比较研究*

施 维**，戚 菁，申娴娟，吴信华，鞠少卿，刘才旺

（南通大学附属医院外科综合实验室，江苏226001）

目的：对比评价人血清游离DNA的分支DNA（bDNA）检测和实时荧光定量聚合酶链反应（RT-qPCR）检测方法。方法：收集44例人血清标本，分别运用bDNA技术和荧光定量PCR检测其游离DNA浓度，对2种方法检测结果做分析比较。同时采用bDNA技术分别检测其中10例血清和血浆游离DNA含量。结果：bDNA技术的检测结果和荧光定量PCR具有较高的相关性（r=0.7077，P<0.0001）；血清较血浆具有较高的游离DNA的水平。结论：bDNA操作简便且结果可信，适用于人群大规模筛查游离DNA水平。

游离DNA；分支DNA；实时荧光定量聚合酶链反应；化学发光免疫分析仪

游离DNA又称循环DNA，是指一种无细胞状态的胞外DNA，存在于血浆或血清、脑脊液及滑膜液等体液中。目前研究提示游离DNA在肿瘤发生的早期就可出现含量上升，是一种非侵袭性的潜在应用价值的肿瘤标志物[1-2]。目前国内外广泛采用实时荧光定量聚合酶链反应（real-time fluorescence quantitative polymerase chain reaction，RT-qPCR）方法检测游离DNA[3]。但此方法准确性和精确性很大程度上依赖于前期样本DNA的提取与纯化步骤。与之相反，分支DNA（branched DNA，bDNA）技术选择人类基因组中短串联重复序列（Alu repeats）作为靶序列，可以直接测定血清样本中游离DNA的含量[4]。但鉴于该技术是新近开展，本研究运用bDNA技术和传统RT-qPCR同时检测游离DNA浓度，对两种方法检测结果加以分析比较。

1 材料与方法

1.1 标本来源 44例血清标本来自本院检验科，其中女32例，男12例，年龄16～72岁。同时从44例血液标本中随机抽取10例，收集其血浆标本。

1.2 方法

1.2.1 血清（血浆）游离DNA含量bDNA检测：按照试剂盒说明制备工作探针工作液WPS（QuantiGene 2.0 Reagent System试剂盒，美国Panomics公司）。随后将DNA标准品用TE缓冲液（Tris+EDTA缓冲液）进行倍比稀释成0、6.25、12.5、25、50、100、200和400 ng/mL，样本用双蒸水1∶20稀释。稀释样本95℃加热5min，冰水即刻冷却。在96孔微孔板中，每孔加入90μL WPS和10 μLDNA稀释样本，锡铂纸封闭微孔板。55℃杂交1h，300μL洗涤液洗涤，402g离心1 min除去残留的洗涤液。1∶1 000稀释前放大体、放大体和标记探针，微孔板每孔加入前放大体、放大体和标记探针工作液各100 μL。锡铂纸封闭微孔板55℃孵育30 min（标记探针50℃孵育）。洗涤微孔板后，每孔添加100 μL底物工作液，锡铂纸封闭微孔板。室温孵育5 min，在化学发光免疫分析仪读每孔数值。以标准品浓度和相对发光单位的读数值绘制标准曲线，根据标准曲线计算每孔游离DNA的浓度，将结果×20求得每个样本的DNA的含量。

1.2.2 血清游离DNA荧光定量PCR含量检测：（1）血清游离DNA的提取：血清DNA抽提和纯化严格按照DNA提取试剂盒的操作步骤说明书进行（QIAmp DNA Mini Kit试剂盒，德国QIAGEN公司）。所有标本均采用同一批号的试剂盒抽提DNA，抽提产物放置20℃保存备用。（2）RT-qPCR检测血清游离DNA含量：PCR引物参照文献[5]的设计，采用重复序列Alu为目的片段，进行PCR扩增。上游引物序列为5'-CCTGAGGTCAGGAGTTCGAG-3'，下游引物序列为5'-CCCGAGTAGCTGGGATTACA-3'，由上海生工公司合成。PCR反应体系为：模板DNA 5 μL，2× FastStart Universal SYBR Green Master（Rox）（罗氏）10 μL，上、下游引物各0.2 μL，加无菌双蒸水补充至20 μL。反应条件为：95℃变性2 min，然后95℃退火15 s，64℃延伸1 min进行40次循环。用ABI 7500荧光定量PCR仪实时进行监测，并绘出各样本溶解曲线验证特异性。实验采用绝对定量的方法，即将浓度为222 μg/mL的人类基因组DNA标准品进行10倍梯度稀释（6个稀释梯度）。并将未知样品和梯度稀释的标准品在同一荧光PCR实验中进行反应，由标准品得到的Ct值构建标准曲线，通过标准曲线推算出待测标本的血清游离DNA含量。

1.3 统计学处理 用GraphPad Prism V5.0统计软件进行统计学分析，双变量相关分析用Spearman相关检验，P<0.05为差异有统计学意义。

2 结 果

2.1 bDNA技术标准曲线的绘制 以人类基因组DNA标准品作倍比稀释，得到浓度为400 ng/mL、200 ng/mL、100 ng/mL、50 ng/mL、25 ng/mL、12.5 ng/ mL、6.25 ng/mL、0 ng/mL（作空白对照）的实验标准品。每个浓度测3孔，其相对发光单位取平均值。以标准品的浓度和平均相对发光单位绘制标准曲线，求得相关系数r2=0.9928，回归直线方程y=122.11x。2.2 RT-qPCR技术标准曲线的绘制 将浓度为222 μg/mL的人类基因组DNA标准品10倍梯度稀释（22 200 ng/mL～0.222 ng/mL）后，根据标准品实验得到的Ct值绘制标准曲线。回归直线方程y= -3.27x+21.56，r2=0.998，PCR扩增效率为102.21%。2.3 两种检测方法样本测定结果比较 分别运用bDNA技术和RT-qPCR法检测44份血清标本的游离DNA含量。其中运用bDNA技术,检测44份血清标本的游离DNA浓度中位数为252.2（123.9~481.4）ng/mL，RT-qPCR法检测的游离DNA浓度中位数为65.5（38.0~131.6）ng/mL。Spearman相关性分析显示，两种方法检测的血清游离DNA水平呈正相关（r= 0.7077，P<0.0001），见图1。

图1 两种方法检测的血清游离DNA比较

2.4 bDNA技术检测血清及血浆标本 采用bDNA技术分别检测10例血清及其对应的血浆标本中游离DNA的浓度。其结果如图2所示。

图2 bDNA技术检测血清和血浆标本中游离DNA浓度

3 讨 论

本研究同时采用新型的bDNA方法及经典的RT-qPCR法，测定人血清游离DNA水平。之前众多针对游离DNA的研究，大多采用RT-qPCR的方法，其准确性和精确性很大程度上依赖于前期样本DNA的提取与纯化步骤。而bDNA技术选择人类基因组中,短串联重复序列作为靶序列，直接测定血清样本中游离DNA的含量。避免了样本预处理的繁琐操作，在达到较高灵敏度的同时又具有较好的重复性[6]。在本实验中，由2种检测方法建立的标准曲线可看出，bDNA技术和RT-qPCR法测定血清游离DNA均具有较好的线性。在同时检测44例血清标本时，2种方法检测结果呈现较高的相关性（r=0.7077）。因此本研究所采用的bDNA，针对Alu序列检测血清游离DNA的方法，具有较高的准确性和可信度。并且bDNA操作简便，适用于人群大规模筛查游离DNA水平。

另外在检测游离DNA水平时，常会出现一些类似的实验采用不同来源的样本（血清/血浆）进行分析而造成结果差异现象[3，7]。本研究通过检测10例人血清和血浆中游离DNA的浓度，得到和以往的实验相一致的结果，即血清样本中的游离DNA水平高于血浆中的水平[8]。这可能是由于血小板中的线粒体DNA和白细胞中的染色体DNA，在血液凝结时释放出来。据此我们认为，无论血清或血浆，均可作为检测游离DNA的实验标本，在临床应用中应建立不同的参考区间。

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Comparative study of two methods for detection of cell-free DNA

SHI Wei,Qi Jing,SHEN Xianjuan,WU Xinhua,JU Shaoqin，LIU Caiwang
(Comprehensive Surgical Laboratory,the Affiliated Hospital of Nantong University,Jiangsu 226001)

Objective:Compare two methods to detect the concentrations of serum cell-free DNA by using branched DNA assay(bDNA)and real-time fluorescence quantitative real-time polymerase chain reaction(RT-qPCR).Methods:44 samples of serum cell-free DNA were measured by both bDNA based on Alu sequence and qPCR.The correlation between the two methods was analyzed by a Spearman rank test.Detection of cell-free DNA in human plasma and serum was analyzed by bDNA.Results:It was demonstrated in the present study that the bDNA method was highly correlated with realtime PCR(r=0.7077,P<0.0001).Cell-free DNA concentrations were higher in serum than in plasma.Conclusion:bDNA assay had advantages of lower time and labor compared to the qPCR method that is applicable to screening consideration.

cell-free DNA;branched DNA assay;real-time fluorescence quantitative polymerase chain reaction

Q523

A

2014-10-09

1006-2440（2014）06-0579-03

南通市科技项目（HS2016056）；南通大学校级自然科研项目（11Z014）。

**[作者简介]施维，男，汉族，江苏南通人，生于1976年6月，硕士，研究实习员。研究方向：分子诊断。 通信作者：刘才旺，副主任技师，E-mail：lcw558@126.com