一例樱桃谷种鸭坦布苏病毒病与呼肠孤病毒病混合感染的诊断

谢海军 傅光华※ 陈红梅 万春和

（1.福建省农业科学院畜牧兽医研究所福州350013；2.江西省赣州市章贡区农业和粮食局能源办赣州341000；3.江西省赣州市章贡区农业和粮食局动物防疫检疫站赣州341000）

一例樱桃谷种鸭坦布苏病毒病与呼肠孤病毒病混合感染的诊断

刘伟1林贵富2谢海军2蔡小敏3傅光华※1陈红梅1万春和1

（1.福建省农业科学院畜牧兽医研究所福州350013；2.江西省赣州市章贡区农业和粮食局能源办赣州341000；3.江西省赣州市章贡区农业和粮食局动物防疫检疫站赣州341000）

江西省赣州地区某种鸭场樱桃谷种鸭发生一起以产蛋下降、个别死亡、卵泡出血和肝脏、脾脏表面有白色坏死点为主要特征的疫病，我们设计特异性引物并以建立的PCR、RT-PCR方法对该病例样品分别进行了禽流感病毒、鸭坦布苏病毒、禽多杀性巴氏杆菌、鸭呼肠孤病毒、产蛋下降综合征病毒、副粘病毒和鸭瘟病毒的检测，结果仅扩增出约330 bp大小的鸭坦布苏病毒特异性条带和约680 bp大小的鸭呼肠孤病毒特异性条带，结合临床剖检病变和实验室检测结果，确诊该病例为鸭坦布苏病毒病与呼肠孤病毒病合感染。

鸭坦布苏病毒病呼肠孤病毒病混合感染诊断

鸭坦布苏病毒病是2010年4月以来发生的一种新鸭病，以采食量迅速下降，产蛋率急剧下降、甚至停产及出现不同程度死亡为主要特征，各品种鸭均有发生。不同地区、不同品种鸭群发病率高低不一，群内发病率几乎为100%，病死率为5%～15%[1-5]。目前，该病的确诊有赖于实验室的检测[6]。

鸭呼肠孤病毒病是由呼肠孤病毒科正呼肠孤病毒属番鸭呼肠孤病毒引起番鸭、半番鸭、樱桃谷鸭、麻鸭等一种病毒性传染病。该病主要发生于40日龄内番鸭，临床上以肝、脾、肾表面有白色坏死点为主要病变，其发病率高，死亡率为10%～50%[7-10]。现将一例樱桃谷种鸭发生鸭坦布苏病毒病与鸭呼肠孤病毒病混合感染的诊断报道如下。

1 发病情况及临床症状

2013年3月，江西省赣州地区某种鸭场饲养的253日龄、近3 500羽樱桃谷种鸭突然发病，采食量明显下降，患鸭体表、两脚发热，发病一周后产蛋率从发病前的89%左右下降到40%，个别患鸭软脚或双脚麻痹，一周内死亡种鸭41羽，病死率1.17%。

2 剖检病变

剖检病死鸭，主要见肝脏、脾脏表面有数量不等的白色坏死点，卵泡严重出血，甚至有的卵泡破裂、卵黄液化流入腹腔中。

3 诊断

3.1 实验室检测

3.1.1 病料采集自病死鸭中无菌采集肝脏（一部分用于细菌分离）、脾脏和出血卵巢，按常规方法匀浆，反复冻融数次，4℃条件下10 000 r／min离心15 min，无菌吸取上清液，于220 nm孔径的滤膜过滤后于-20℃冻存备用。

3.1.2 细菌分离与鉴定用灭菌铂耳从采集的肝脏样品中挑取少量样品，在血琼脂平板上划线培养，然后将平板倒置于37℃恒温箱培养24 h，未观察到任何细菌生长，则可排除细菌感染。

3.1.3 病毒检测

3.1.3.1 主要试剂RNA提取试剂盒购于TIANGEN有限公司（北京）；AMV反转录酶、RNA酶抑制剂Ribonuclease Inhibitor、DL 2000 DNA Marker等试剂均购于宝生物工程（大连）有限公司；DNA提取试剂盒，dNTP Mix、Fast Pfu fly DNA聚合酶购自北京全式金生物技术有限公司。

3.1.3.2 引物设计根据GenBank提供的禽流感M基因、鸭坦布苏病毒NS5基因、鸭呼肠孤病毒M3基因、产蛋下降综合征病毒PⅧ基因、副粘病毒F基因和鸭瘟病毒UL基因的序列，分别设计特异性引物，由生工（上海）生物工程有限公司合成。

3.1.3.3 核酸提取和病料处理取冻存的病料上清液，分别按病毒RNA提取试剂盒操作说明书和病毒DNA提取试剂盒操作说明书提取病料的组织病毒DNA。将其中提取的病毒RNA反转录合成cDNA（具体操作参照AMV反转录酶使用说明书），反转录的引物为6碱基随机引物，反转录合成的cDNA放置于-20℃保存备用。

3.1.3.4 病毒检测从处理好的待检样品中，可扩增出约330 bp的与预期大小相符的鸭坦布苏病毒特异性条带（见图1），对测序结果比对分析发现，与我国ZJ 407株，ZJ-6株及ZJ GH-2株鸭坦布苏病毒NS5基因同源性高达99%，则确定为鸭群感染鸭坦布苏病毒病。

另同时从处理好的待检样品中，可扩增出约680 bp与预期大小相符的鸭呼肠孤病毒特异性条带（见图2），对测序结果比对分析发现，与AVS-B株鸭呼肠孤病毒的同源性最高达99%，而与919株和S1133株鸡源呼肠孤病毒核苷酸同源性较低为86%，则可确定为鸭群也感染鸭呼肠孤病毒病。

图1 鸭坦布苏病毒检测结果（1：阳性对照；2：待检样品；M：DL2000DNA Marker）

图2 呼肠孤病毒检测结果（1：阳性对照；2：待检样品；M：DL2000DNA Marker）

3.2 诊断根据发病情况、临床症状和剖检病变，结合实验室检测结果，确诊该病为鸭坦布苏病毒病与呼肠孤病毒病混合感染。

4 分析与体会

1）鸭坦布苏病毒病发病突然，传播快速，可感染蛋鸭、种鸭、蛋鸡和鹅[11]。在临床上主要表现为采食量突然大幅下降，产蛋率骤降，由高峰期的90%～95%下降至5%～10%。发病率可高达100%。在该病流行的早期，患鸭一般不出现神经症状；而在流行的后期，神经症状明显，表现瘫痪、行走不稳、共济失调。具有神经症状的发病鸭可见脑膜出血，脑组织水肿[12]。

2）呼肠孤病毒病主要发生于肉鸭，种鸭中很少见到，临床上以软脚、腹泻、生长障碍为主要症状，以肝、脾表面坏死等为主要病变。耐过鸭生长发育缓慢，成为“僵鸭”。

3）近年来，养鸭生产中疫病流行常呈现混合感染，两种甚至多种疫病同时发生，通过临床表现以及病理变化已难以确诊，常需进行实验室检查。由于H5亚型禽流感病毒、H9亚型禽流感病毒、鸭坦布苏病毒、产蛋下降综合征病毒、禽I型副黏病毒、呼肠孤病毒等都能引起鸭产蛋下降[13-14]。因此，对于该病例以设计的特异性引物对其分别进行检测，结果鸭坦布苏病毒和呼肠孤病毒呈现阳性，表明是鸭坦布苏病毒病与呼肠孤病毒病混合感染，提示呼肠孤病毒在种鸭也有感染。

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B

1003-4331（2014）04-0070-03

现代农业产业技术体系建设专项资金资助（CARS-43）。

刘伟（1989-），男，硕士研究生，从事动物病原与分子生物学研究（E-mail：756149217@qq.com）。

傅光华（1977-），男，副研究员，从事动物分子病毒学研究（E-mail：fuyuan1981@gmail.com）。