蒙小云 ,郑 华 *,李 勇,夏代刚 ,窦红伟 ,石 伟 ,田家宁
(1. 深圳市农牧实业有限公司,深圳 518023;2. 深圳华大方舟生物技术有限公司,深圳 518083)
本研究旨在优化克隆猪胚胎移植技术,力求降低操作成本、提高效率和简化操作,推进克隆猪试验向产业化应用迈进。猪的克隆相对于牛羊等家畜难度大,直到2000年才获得世界首例体细胞克隆猪。国内外已开展了不少克隆猪试验,猪的克隆效率基本维持在1%~2%。胚胎移植成功率是影响克隆猪效率的主要因素。
试验中所需材料包括:断奶发情母猪、培育好的克隆胚胎数枚、无菌操作实验室、手术台、手术麻醉系统一套、手术刀、缝合针线等。要求试验母猪单独饲养,术前清洁并彻底消毒;移植的胚胎要求发育良好,严格按照恒温38.5 ℃保存;手术前对手术室进行24 h紫外线照射处理;对手术人员手术前做好消毒净化工作;手术所用的刀具、耗材做好消毒灭菌工作。确保胚胎移植过程处于无菌操作。
1.2.1 供体的选择
在试验开始前,根据公司种猪群育种数据,选择遗传指数高的,生产性能好的公猪作为此次试验的供体。
1.2.2 体细胞采样
保定好供体,采样人员对供体耳缘周边进行消毒清理,剃掉皮肤上层的绒毛,用采样器剪取0.5 cm×0.5 cm的耳肉,装入样品管,放入专用冷冻箱保存。
1.2.3 胚胎建系
将采好的样品送至深圳华大方舟生物技术有限公司进行胚胎建系。
1.2.4 胚胎选择
建好胚胎系之后,胚胎挑选原则是尽量选取形态良好、扩张充分、内细胞团明显的囊胚。
胚胎受体的选择主要关注以下几方面:分娩过程长短正常、异常仔猪少、产后恢复快、未有子宫炎症状及奶水好的母猪,同时选择断奶发情要在7 d以内的母猪,而且发情症状要很明显。
1.4.1 受体断奶时间
在确定了手术移植时间后,反推母猪断奶时间,即手术时间反推5 d为发情日期,发情日期反推6 d为断奶日期。
1.4.2 移植胚胎发育日龄
经过手工克隆出来的,发育6 d的胚胎。
1.5.1 移植胚胎的准备
用专门的拣胚器对拟移植的胚胎进行分拣并装入麦管,每头受体母猪准备2个麦管,每个麦管大约装入30枚胚胎。将装好胚胎的麦管放入恒温的运输箱。
1.5.2 受体母猪
对断奶母猪进行断奶后优饲,确保受体母猪发情良好,发情后对受体母猪实行单栏饲养,术前做好清洗及消毒工作,手术前12 h禁食。
1.5.3 手术仪器准备和检查
准备手术器械,纱布锅,手术服,外科手术手套、口罩、缝线、洞巾、磺胺、生理盐水、碘酊、酒精、酒精棉。对所有进入手术室的器材都要进行灭菌处理。首先确定手术需要几套灭菌器材,灭菌前用洗洁精清洗器材,然后通过高压蒸汽锅进行高压高温灭菌;高压蒸汽锅在103.4 kPa蒸汽压下,温度达到121.3 ℃,维持15~20 min,即可达到灭菌的效果;已灭菌的物品做好标记,与未灭菌的物品分开保存,以免弄错。
1.6.1 先期麻醉及固定
肌注受体母猪8~10 mL阿托品,抗痉挛,15 min后静脉注射舒泰50,体重小于等于150 kg使用2~2.2 mL,大于150 kg使用2.2~2.8 mL。然后将受体母猪固定到手术架上;在手术过程中为了维持麻醉状态,我们使用动物麻醉机来达到这个效果。动物麻醉机的原理是结合氧气和笑气的混合气体以及挥发性异氟烷来维持麻醉作用。通过这种办法使受体母猪在整个手术过程中处于麻醉状态,方便了手术操作。
1.6.2 开腹手术
步骤1:铺开洞巾,用4个持巾钳固定于皮肤表面,避免夹到乳头,影响后期泌乳。
步骤2:在倒数第2、 3个乳头之间,用手术刀切开皮肤及皮下结缔组织,准备止血纱布和止血钳用以较小血管止血,提前准备非吸收性外科缝线,时刻准备对较大出血血管进行结扎。
步骤3:用止血钳或手术刀沿腹白线进行分离脂肪层。
步骤4:分离脂肪层直至腹膜,切开腹膜。
步骤5:纱布摊开,上面喷洒一定量的生理盐水,防止子宫脱水。
步骤6:从腹腔引出子宫,检查卵巢的排卵情况,遇到排卵时间过早或过晚或子宫粘连严重的情况时,需放弃移植,更换受体。
步骤7:找到宫管结合处,用灭菌钝性针头扎一个小孔,整个过程要适时向子宫喷洒生理盐水,保持子宫湿润,不致脱水。
步骤8:用移植导管将胚胎缓慢输入子宫角,然后用手指或止血钳夹持小孔一段时间,防止出血。
步骤9:另一侧子宫同上进行。
1.6.3 缝合
胚胎注射完毕后,需要对受体母猪进行术部缝合,具体步骤如下:
步骤1:止血纱布清除手术部位的血渍,将子宫还原入体内,在腹腔内加少量的生理盐水清洗腹腔,在腹腔内灌入右旋糖酐50 mL和2:160万单位青霉素。
步骤2:采用连续缝合法用吸收性外科缝线对腹膜进行缝合,缝合时,针间距不宜过大,过大会导致肠管露出腹腔发生疝气,以小于1 cm为宜。
步骤3:同样方法对肌肉层和脂肪层进行缝合,撒磺胺,进行消炎。
步骤4:用非吸收性缝线缝合皮肤层,采用结节性缝合。
步骤5:缝合完毕,用手术镊将缝合部位皮肤外翻,便于愈合,手术镊夹碘酊消毒手术部位。
步骤6:关掉麻醉罐,为保证麻醉动物安全,可继续通氧气,辅助呼吸一段时间。
待受体母猪完全清醒后,单独饲养管理,视伤口愈合情况决定是否需要相应治疗。如恢复良好,按照配种后1个月母猪标准进行饲养管理,在28 d时通过B超进行查孕,确定受体是否怀孕。
2012年10月-12月,我们用手术法共开展16头母猪的克隆猪胚胎移植试验(表1)。结果14头手术法移植的母猪全部陆续返情,移植分娩率仅为12.5%(2/16),一窝产了3头木乃伊,另一窝产了3头活仔和1头木乃伊,移植效果不理想。
2013年6月,我们根据手术法改进方案开展了8头母猪的克隆猪胚胎移植试验,此轮受体代孕母猪全部选用了长白经产母猪,8头猪分娩了4窝,其余4头母猪返情。本轮手术法移植分娩率为50%(4/8),共分娩26头活仔和4头死胎,窝均分娩6.5头活仔和1头死胎,移植效果比较理想。
2013年6月根据改进方案手术移植的母猪有4头过了一个情期没有返情,而且用超声波检测已经怀孕,坚定了我们对试验成功的信心。于是,8月8日和8月18日我们又手术法移植了2头母猪,结果分别于11月24日和12月5日分娩,分别分娩8头和4头活仔,分娩率达到了100%(2/2),窝均分娩6头活仔。
综合2013年6—8月的手术法胚胎移植结果,10头受体母猪合计分娩率达到60%(6/12),窝均分娩活仔6.33头(38/6)。
影响猪克隆试验成败的因素很多,吴蓉花等综述了提高猪胚胎发育能力和克隆效率的研究进展。本试验通过不断摸索和总结,优化了胚胎移植操作,逐步提高了胚胎移植成功率。主要的优化措施包括:
表1 第1批手术法克隆猪胚胎移植试验结果
表2 改良后手术法克隆猪胚胎移植试验结果
供体采样时,样本是否被污染,以及供体本身的年龄、健康状况等因素对胚胎的建系和发育都有一定的影响,考虑到以上因素,在后面的供体采样时我们分别尝试了皮下脂肪采样以及胎猪采样,从建系的情况来看,明显的优于耳缘采样。
根据之前采样及移植情况来看,供体体细胞采样受供体本身发育情况、体细胞分化及甲基化影响、样本保存运输情况等因素影响较大,结合这些情况我们通过采取30 d怀孕母猪的胚胎,作为体细胞提取样本,能大大的优化胚胎的建系成功率。
对有子宫炎症,有子宫粘连、水肿、发育不理想等的受体母猪应放弃移植。由于我场兼顾生产,在选择受体母猪时没有太过严格地筛选,实验个体水平参差不齐,这是导致第1批移植试验成功率低的主要原因。从第2批胚胎移植开始,在选择受体时,尽量选择年龄适中、生命力旺盛、分娩时无异常产仔、子宫产后恢复良好、产房无发病情况、哺乳性能良好、断奶发情时间准确、发情特征明显的母猪。
手术法开展胚胎移植,任何细微的不当操作都足以导致胚胎无法着床和死亡。本试验通过摸索总结出了一套手术法克隆猪胚胎移植操作标准,虽然目前仅仅是企业标准,相信通过不断修订和完善,可逐步上升成行业标准。
手术后,胚胎进入受体子宫内,能否着床及发育,这与受体子宫的内部环境、激素分泌、营养状况以及疾病的影响是分不开的。术后对受体母猪的饲养管理应细致,注意观察受体母猪手术恢复情况,有无被感染,是否需治疗,母猪饲喂料量应根据母猪体况适当调整。细致的管理是保障克隆胚胎在子宫内着床及发育的关键因素。