偶氮荧光桃红的固定化漆酶脱色及动力学研究*

常林，任玥，王红霞

（功能材料的设计合成与绿色催化黑龙江省高校重点实验室，哈尔滨师范大学化学化工学院，黑龙江哈尔滨150025）

偶氮荧光桃红的固定化漆酶脱色及动力学研究*

常林，任玥，王红霞

（功能材料的设计合成与绿色催化黑龙江省高校重点实验室，哈尔滨师范大学化学化工学院，黑龙江哈尔滨150025）

采用交联剂戊二醛将漆酶固载在Fe3O4/SiO2纳米粒子上，用于偶氮荧光桃红的脱色降解研究。试验结果表明，固定化漆酶对10～70mg·L-1偶氮荧光桃红脱色率均可达到90%以上，降解率可达到70%，降解效果明显，而且固定化漆酶能够重复使用。染料的脱色反应动力学满足一级反应动力学规律，固定化漆酶催化偶氮荧光桃红的脱色反应米氏常数Km值为567.27mg·L-1。

固定化漆酶；偶氮染料；脱色；动力学

偶氮染料是使用最为频繁的染料，它广泛应用于皮革、纺织、化妆品、食品等行业[1，2]。偶氮染料是通过化学合成来生产的，自然界中不存在。所以偶氮染料的化学稳定性高，结构复杂，具有抗光抗氧化的能力，很难被微生物降解。因此，降解偶氮染料废水的研究尤为重要[3]。

生物酶作为一种生物制剂，无毒无害，并且具有专一性、高效性、温和性三大特性，在染料废水处理中能有效地去除色度以及染料的降解，因而具有良好的应用前景[4]。近年来，国际上对漆酶的固定化进行了较广泛的研究[5-7]，采用的固定化载体包括硅胶、活性炭、壳聚糖、亲水性微滤膜和一些磁性材料。漆酶在经过磁性Fe3O4/SiO2载体固定化后，化学稳定性极大提高，高于游离漆酶，包覆均匀、尺寸均一、精小、磁分离性能良好。同时可以延长使用周期和寿命，又可以磁性回收，循环利用、降低成本。因此，近年来用磁性载体材料固定化漆酶越来越受到重视。

本实验以磁性Fe3O4/SiO2为载体，成功实现了漆酶的固载，以期实现漆酶经过固定化后其催化效率可以得到很大改善，使漆酶降解的脱色率进一步提高。进一步研究脱色降解偶氮荧光桃红的动力学规律，为工业化的应用开辟了广阔的前景且具有重要的研究意义。

1 实验部分

1.1 主要试剂和仪器

氯化亚铁（FeCl2·4H2O）；三氯化铁（FeCl3·6H2O）；正硅酸乙酯（TEOS）；异丙醇；漆酶（Sigma-Aldrich）；3-氨基丙基三乙氧基硅烷（APS）；戊二醛（天津市科密欧化学试剂中心），偶氮荧光桃红（阿拉丁试剂）。

Lambda45紫外可见分光光度计；DF-Ⅱ恒温油浴锅；JJ-1精密增力电动搅拌器。

1.2 固定化漆酶制备

将100mg Fe3O4/SiO2加入40mL乙醇中后超声，加入0.2mLAPS,室温搅拌12h后蒸馏水洗、磁分数遍，即得到氨基修饰的Fe3O4/SiO2粒子。向载体中加入一定量的戊二醛，室温下搅拌3～4h得到交联的复合粒子，用PBS洗涤数遍后溶解在pH值为7.0的磷酸缓冲液中。称取适量的漆酶溶解于PBS溶液中，再加入上述溶液中，室温搅拌12h,洗涤，保存在pH值为7.0的磷酸缓冲液，即得到固定化漆酶，放入4℃的冰箱中，备用。

1.3 固定化漆酶对染料的脱色和吸附

用Lambda45紫外可见分光光度计在300～800nm波长范围内对偶氮荧光桃红溶液扫描，测出最大吸光度的波长为531nm。取50mg固定化漆酶或载体与15mL质量浓度分别为10～70mg·L-1偶氮荧光桃红溶液反应。测出反应前后染料在531nm处的吸光度，从而测出脱色率和吸附率。

1.4 固定化漆酶米氏常数

将5、10、15、20、30、40、60、100mg·L-1偶氮荧光桃红的溶液，测定531nm处吸光度变化从而得到固定化漆酶脱色的初速度.做出横坐标为以底物浓度（C）的倒数，纵坐标为酶反应初速度（v）的倒数的Lineweaver-Burk双倒数图，由双倒数法求得固定化酶的Km值和Vmax值。

2 结果与讨论

2.1 固定化漆酶对偶氮荧光桃红的脱色

2.1.1 时间对脱色率和吸附率的影响

图1 反应时间对偶氮荧光桃红脱色和载体吸附的影响Fig.1 Effect of reaction time on decoloration of Azophioxine solution by immobilized laccase and support（adsorption）

从图1中看出,反应20min 10～70mg·L-1偶氮荧光桃红溶液的脱色率明显增加，达到90%以上，20min后随着反应时间的继续升高，偶氮荧光桃红溶液的脱色率变化趋于平缓，表明100min后固定化漆酶对偶氮荧光桃红溶液的脱色比较充分。固定化漆酶对偶氮荧光桃红的脱色具有降解和载体吸附两部分作用，对偶氮荧光桃红的吸附在10%左右。所以固定化漆酶对10～70mg·L-1的偶氮荧光桃红溶液的降解率达到70%。在20min处，从10～50 mg·L-1，随着染料浓度的增大，脱色率也随之增大，分别为90.2%、94.6%、97.7%。但当浓度为70mg·L-1时，脱色率下降为96%。说明染料浓度达到一定程度时，再继续加大染料浓度，漆酶并不能实现染料的完全降解，更可能是一部分染料堵塞了漆酶的活性中心。

2.1.2 固定化漆酶对染料脱色的循环使用将10mg·L-1、pH值为7的偶氮荧光桃红染料与固定化漆酶反应，在25℃下振荡反应30min，测定脱色率。将反应液磁分回收固定化漆酶，用pH值为7的PBS缓冲液洗涤多次，重新用于脱色反应，如此重复8次。

图2 固定化漆酶循环降解偶氮荧光桃红染料Fig.2 Performance of immobilized laccase for decolorizing azophioxine solution for 8 cycl

由图2可见，使用8次后脱色率较初始脱色下降了6%，说明固定化漆酶对偶氮荧光桃红脱色具有较好的循环使用率。固定化漆酶具有较好的催化效率。

2.2 固定化漆酶脱色动力学研究

2.2.1 固定化漆酶的米氏常数（km）

图3 染料浓度对反应速率的影响Fig.3 Effect of reaction rate on initial concentration

由图3中可以看出，在底物浓度较小时呈线性上升，当底物浓度继续增大时，反应速度增大缓慢，并逐渐平缓趋于极限值。这种趋势说明，固定化漆酶催化的反应，符合米氏方程所描述的反应速率随底物浓度的变化规律。当反应达到Vmax的一半时所对应的底物浓度就是米氏常数Km，它是反映漆酶对底物亲和力的大小，Km的数值越小，说明底物与酶之间的亲和力越强。

图4 固定化漆酶的Lineweaver-Burk双倒数曲线Fig.4 Lineweaver-Burk plots for immobilized laccase

由图4可知，以偶氮荧光桃红为底物时，漆酶的米氏常数（Km）和最大反应速率（Vmax）分别为567.27和1.817mg·（L·min）-1。说明固定化漆酶与游离漆酶（游离漆酶测不出Km）相比，固定化漆酶对偶氮荧光桃红具有更好的亲和力。因此，固定化漆酶对偶氮荧光桃红的催化迅速而有效。

2.2.2 固定化漆酶脱色动力学反应级数将不同初始浓度的偶氮荧光桃红,吸光度与反应时间的变化关系按照一级反应动力学进行拟合，绘制ln（C0/Ct）与t曲线,见图5。

图5 不同偶氮荧光桃红初始浓度时ln（C0/Ct）与t的关系Fig.5 Relationship of ln（C0/Ct）and t under different initial concentration of azophioxine

表1 偶氮荧光桃红初始浓度对表观一级速率常数k的影响Tab.1 Initial dye concentration on the reaction rate constant

由图5可知,ln（C0/Ct）与t呈线性关系,见表1，反应动力学相关系数都在99%左右，表明偶氮荧光桃红脱色过程符合一级反应动力学规律。偶氮荧光桃红的表观一级反应速率常数k随初始浓度的增大而减小。

3 结论

固定化漆酶对偶氮荧光桃红具有较好的降解效果，降解率能达到70%。随着浓度的增加降解程度先增加后降低。固定化漆酶对偶氮荧光桃红脱色具有较好的循环使用率。使用8次后脱色率较初始脱色率仅下降了6%。以偶氮荧光桃红为底物时，固定化漆酶的米氏常数（Km）和最大反应速率（Vmax）分别为567.27和1.817mg·（L·min）-1。偶氮荧光桃红脱色过程符合一级反应动力学规律，一级反应速率常数k随初始浓度的增大而减小。

［1］AStolz.Basic and applied applied aspects in the microbiald degradation of azo dyes［J］.Microbial Biotechnology，2001，56（1-2）：69-80．

［2］A Pandey，P Singh，L Iyengar．Bacterial decoiorization and degradation ofazo dyes［J］.Biodeterior Biodegrad，2007，59（2）：73-84.

［3］尹亮，陈章和，赵树进.微生物对偶氮染料的脱色及其基因工程研究进展［J］.生物技术，2007，17（6）：86-89．

［4］周文龙.酶在纺织中的应用［M］.北京:中国纺织出版社，2002

［5］Duran N,Rosa M A,D'Annibale A，et al.Applications of laccases and tyrosinases（phenoloxidases）immobilized on different supports;a rview［J］.Enzyme Microb Technol,2002,31（7）:907-931.

［6］Wan Y Y,Du Y M,Shi X W et al.Immobilization and characterization oflaccsae from Chinese Rhus vernicifera on modified chitosan［J］.Process Biochemistry,2006,41（6）:1378-1382.

［7］JolivaltC,Brenon S,Caminade E et al.Immobilization oflaccase from Trametes vesicolor on a modified PVDF microfiltration membrane: chaa in wastewater［J］.J Membr SCI,2000,180（1）:103-113.

Study on degradation of azophloxine in the presence of immobilized laccase

CHANG Lin，REN Yue，WANG Hong－xia
（Key Laboratory of Design and Synthesis of Functional Materials and Green Catalysis,College of Chemistry and Chemical Engineering,Harbin Normal University,Harbin 150025,China）

The degradation of azophloxine in the presence of laccase immobilized on the amino－modified magnetic Fe3O4/SiO2nanoparticles was investigated in this study.When the concentration of azophioxine was in the 10～70mg·L－1，the decolorization percentage of azophioxine by immobilized laccase could reach over 90%and degradation percentage could reach 70%in sequential eight cycles.In the meantime,the kinetics of decolorization reaction was generally corresponding with first order reaction kinetics models.The Km values of immobilized laccase for azophioxine was 567.27mg·L－1.

immobilization of laccase；azo dye；decolorization；kinetics

TQ613.1

A

1002－1124（2014）03－0009－03

2013-01-17

黑龙江省自然科学基金（B201011）

常林（1987-），男，在读硕士研究生，研究方向：染料废水降解。

导师简介：王红霞（1974-），女，教授，博士，硕士研究生导师，主要从事多孔材料、Fe3O4/SiO2基负载型催化剂的设计、制备及甲烷转化、有机污染物的去除等催化反应的研究。