结核分枝杆菌MTB8.1蛋白自诱导发酵研究

聂 恒，高志芳，吴利先*

（1.大理学院基础医学院，云南大理 671000；2.北京四环科宝制药有限公司，北京 100070）

结核分枝杆菌MTB8.1蛋白自诱导发酵研究

聂 恒1，高志芳2，吴利先1*

（1.大理学院基础医学院，云南大理 671000；2.北京四环科宝制药有限公司，北京 100070）

目的：初步摸索出一条适合工业化开发、高效的、可溶表达结核分枝杆菌MTB8.1蛋白的发酵工艺。方法：利用菌株pUC18∕MTB8.1∕DH10B为发酵株，通过对培养基组成和发酵参数进行系统研究，从而获得一全新的发酵工艺。结果：重组结核分枝杆菌MTB8.1蛋白通过本发酵工艺的表达，单位体积发酵液可溶性蛋白的产量大幅提高，每升发酵液纯化得到可溶性蛋白约30 mg左右。结论：初步摸索出一条较好的MTB8.1在大肠埃希菌系统中的可溶性表达的途径，为其工业化生产奠定了理论基础。

结核分枝杆菌；MTB8.1蛋白；可溶性表达；发酵工艺；抗原性

结核在全世界范围内仍然是最具威胁的传染病之一，近年来许多国家结核的发病率增高，我国每年新增感染人数多达130万，成为单一致病菌引起死亡率最高的传染病〔1-4〕。且自20世纪80年代以来艾滋病在全世界范围内的播散，结核的发病率也随之快速上升，人类免疫缺陷病毒结核分枝杆菌（Human immunodeficiency virus-Tuberculo⁃sis，HIV-TB）复合感染的结核病患者的比例升高，而且严重影响了复合感染者的生命质量，同时也是复合感染者的一个重要致死原因〔5-10〕。所以目前需一种针对复合感染者结核感染检测的快速有效的诊断方法。由于复合感染者自身的免疫特点，传统的结核菌素试验受到了限制，目前基于血清学的抗原检测是国内外学者研究的热点。Ray⁃mond等〔11〕研究发现在HIV-TB复合感染的人群中，用MTB8.1蛋白抗原检测比单用TbF6和DPEP检测其灵敏度提高23.8%，若用TbF6-DPEPMTB8.1联合检测其灵敏度提高37.5%。因此在感染HIV的高危人群中检测对抗MTB8.1的抗体，可以作为未出现临床症状但已感染结核的诊断标志，让患者可以从早期治疗中受益。这与Hen⁃dricksom等〔12〕和Lall等〔13〕的研究发现相符。目前以大肠埃希菌为宿主的原核表达系统往往会形成大量包涵体表达，复性后蛋白活性低且复性率也很低。本研究中，我们通过对培养基的组成以及相应的发酵工艺进行了系统的研究，实现了MTB8.1的高效可溶性表达，为以后的工业化放大开辟了新的途径。

1 材料与方法

1.1菌种克隆载体pUC18∕MTB8.1∕DH10B由大理学院基础医学院微生物学及免疫学教研室保存。

1.2主要试剂酸水解干酪素、酵母提取物购自Sigma公司；其它试剂购自生工生物工程（上海）股份有限公司；所用抗体为大理学院基础医学院微生物学及免疫学教研室保存血清样本；结核阳性血清和阴性血清由云南省大理州疾病预防控制中心提供。

1.3培养基组成研究培养基参照Studier方法优化〔14〕，培养基基本组成:2.5%酸水解干酪素、1.0%酵母提取物、50 mmol∕L PB（pH值7.4）、1.0%甘油、0.1%葡萄糖、0.2%α-乳糖。发酵条件选用：1 000 mL三角瓶，装料400 mL，摇床转数200 r∕min，种子过夜培养16 h，接种量1 000:2（V/V），培养24 h，离心收集菌体，菌体重悬后，超声破碎，然后离心弃沉淀，上清经Ni-亲和层析纯化，超滤浓缩。通过改变甘油的浓度、葡萄糖的浓度、乳糖浓度、磷酸盐缓冲液浓度，观察对单位体积发酵液菌体重量和可溶性目的蛋白产量的影响。

1.4发酵工艺研究发酵条件选用：1 000 mL三角瓶，装料400 mL。培养基选用“1.3”项下筛选出的最适单因素组合培养基，离心收集菌体，菌体重悬后，超声破碎，然后离心弃沉淀，上清经Ni-亲和层析纯化，超滤浓缩；通过研究种子生长曲线，确定种子培养时间；改变表达温度、表达时间、溶氧条件，分析收菌量及目的蛋白表达水平。

1.5 ELISA检测采用间接法，将纯化的结核分枝杆菌rMTB8.1蛋白（1 μg∕mL）包被96孔酶标板，4℃过夜；用PBST洗涤后加入1∶1 000稀释的待检血清，37℃温育1 h，再用PBST洗涤；加入1∶2 000稀释的辣根过氧化物酶标记的羊抗人IgG，37℃温育1 h；再用PBST洗涤，加入邻苯二胺和双氧水底物显色30 min，以2 mol∕L硫酸终止反应。以空白对照调校零点，用酶联免疫检测仪测定450 nm的OD值，取2孔平均值作为终结果，然后进行统计学分析。

2 结果与分析

2.1培养基的组成对发酵的影响

2.1.1 甘油的含量对发酵的影响 甘油作为一种简单碳源，对促进高密度发酵影响很大，培养基中含有一定浓度的甘油时能够在一定程度上促进本菌株高密度发酵，当其含量为1%时，其发酵密度和目的蛋白的产量是最高的。见图1。

图1 甘油含量对发酵的影响

2.1.2 α-乳糖的含量对发酵的影响 一定浓度的α-乳糖能够促进菌体的高密度培养，但是目的蛋白的产量却呈现下降的趋势，甘油含量在0.8%左右时，本菌株的发酵密度是最高的，但是随着甘油含量的增加每升发酵液的目的蛋白的产量从32 mg下降至28 mg左右。见图2。

图2 α-乳糖含量对发酵的影响

2.1.3 葡萄糖的含量对发酵的影响 一定浓度的葡萄糖可以促进细菌高密度表达，同时可以降低其本底表达，0.4%的葡萄糖是最适宜本菌株高密度表达的，但是最适合目的蛋白表达的葡萄糖浓度在0.2%左右，综合目的蛋白产量和成本因素，选0.2%的葡萄糖作为培养基的最适浓度。见图3。

图3 葡萄糖含量对发酵的影响

2.1.4 PB缓冲液的浓度对发酵的影响 高密度发酵过程中，由于产酸量较大，所以在培养基中加入适量的缓冲液，有利于稳定培养基的pH值，通过缓冲溶液可以将pH值稳定在6～7之间，发现本菌株生长情况相差不大，但是PB缓冲液浓度在20 mmol∕L时目的蛋白产量最高。见图4。

图4 PB缓冲液浓度对发酵的影响

2.2表达条件对发酵的影响

2.2.1 种子MTB8101生长曲线 从斜面挑取菌落接种于LB培养基中，按实验设定的时间取样，测定菌体浓度，接种时种子液要有一定浓度和较高菌体活力，可以看出，培养8～10 h的菌体处于对数期生长中前期，活性很高，且浓度较高适宜接种扩大培养。见图5。

图5 种子MTB8101生长曲线

2.2.2 表达时间对发酵的影响 相对于IPTG诱导表达，自诱导发酵所需要的时间较长，表达20 h时目的蛋白产量是最高的，同时发现菌体的产量和目的蛋白产量没有相关性。见图6。

图6 表达时间对发酵的影响

2.2.3 表达温度对发酵的影响 从24～38℃温度区间，菌体产量和温度随温度的升高而增加，目的蛋白产量和温度升高呈正相关，并且发现当表达温度上升到30℃后明显提升，然后缓慢增加，37℃表达量最高。见图7。

图7 表达温度对发酵的影响

2.2.4 溶氧条件对发酵的影响 由于实验室条件限制，本实验仅从改变摇床转速，来研究溶氧对本发酵体系的影响，溶氧条件对本实验体系菌体产量和目的蛋白产量影响不大，但是，结果发现摇床转速在180～200 r∕min时，菌体产量和目的蛋白产量相对高一些。

3 ELISA检测结果

ELISA检测结核病患者血清标本，分别检测阳性组和正常人血清标本。结果判断，以样品稀释液作为空白对照，读取OD450值，阳性值：阴性值≥2.1，判读为阳性。85例肺结核病患者血清中检出阳性27例，阳性率31.7%；40例非结核肺部感染患者血清中检出阳性3例，阳性率7.5%；10例健康对照血清均为阴性。该方法的敏感性为31.7%、特异性为92.5%，符合率51.2%。

4 讨论

分子生物学已发展到后基因组和蛋白质组学的时代，高通量地表达可溶性蛋白是当今研究的热点，传统的IPTG诱导蛋白表达不但操作繁琐，同时包涵体经常会出现，文献〔15〕报道，原核表达的MTB8.1重组蛋白，大部分为包涵体表达，复性得率很低，并且复性得到目的蛋白活性也较低，很难被广泛应用，因此支持MTB8.1可溶性表达的培养基组成成分及其发酵工艺参数的研究，是生产高活性、可溶性好的MTB8.1蛋白前提，也是实现MTB8.1工业化生产的亟待解决的课题。本研究通过对其培养基主要成分和主要发酵工艺参数的单因素实验，初步建立了基础发酵工艺，同时也发现了一些问题，需要后续的实验继续研究论证。首先，培养大肠埃希菌使用的培养基，组成成分简单，不能满足高密度发酵对营养的要求，本研究将基础碳氮源的主要成分进行了适当优化，对其含量进行适当的提高，大大提高了该菌株的发酵密度，为提高目的蛋白的产量奠定了基础；其次，由于代谢物阻遏效应大肠埃希菌在耗尽外源葡萄糖之前不会诱发Lac操纵子，我们在培养基中加入一定量的葡萄糖就可以阻止非目的性的诱导表达；第三，为了减少高密度培养而产酸过多对培养基过酸的影响，初步摸索出了的适宜的磷酸缓冲液的浓度，对稳定整个发酵过程培养基的酸碱环境至关重要；第四，培养基代谢分解乳糖处于较低浓度已经足够诱导目的蛋白的表达，无需再额外加入乳糖；第五，通过研究发现本菌株的最适宜培养温度为37℃，可能是本载体的表达速度本来就慢，不宜表达包涵体，因此在较高的温度时适宜其表达；第六，我们选用了处于对数生长前期的种子进行扩大培养，保证了种子的活力和浓度，为实现高密度表达奠定了基础；第七，由于实验条件的影响，实验通过改变摇床的转速来研究溶氧对其发酵的影响，发现180 r∕min时目的蛋白产率最高，因此适宜的溶氧条件对本菌株的发酵也是至关重要的；第八，实验将目的蛋白基因序列插入pUC18的Lac Z基因，运用载体Lac Z自身的表达元件进行目的蛋白的表达，使其表达速度更倾向于可溶性表达，实验的结果也证明了这一点。我们通过对培养基的调整和发酵工艺的优化，初步摸索出一条较好的MTB8.1在大肠埃希菌系统中的可溶性表达的途径，但是，由于时间有限，本研究仅对本菌株发酵的培养基主要组成和主要发酵参数进行了简单单因素实验，还没有对其进行系统的多因素交叉实验，需要后续相关研究，为实现MTB8.1在大肠埃希菌系统中高效、可溶表达提供更加系统的理论基础。

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*通信作者：吴利先，教授，博士.

（责任编辑 李 杨）

The Study of Auto-inducing Fermentation of Mycobacterium tuberculosis Protein MTB8.1

NIE Heng1,GAO Zhifang2,WU Lixian1*
（1.Pre-clinical College,Dali University,Dali,Yunnan 671000,China;2.SHKB Pharmaceutical Co.,Ltd.,Beijing 100070,China）

Objective:To explore an effective fermentation process of Mycobacterium tuberculosis protein MTB8.1 with soluble expression,which would be suitable for industrial development.Methods:Strain pUC18∕MTB8.1∕DH10B was used as fermentation strain and a systematic study of the composition of medium and the parameters of fermentation was conducted to obtain a new fermentation process.Results:By means of the new fermentation process,the yield of soluble recombinant protein MTB8.1 was greatly increased in per unit volume of fermentation broth,with about 30 mg of soluble protein obtained from every liter of fermentation broth through purification.Conclusion:A better way of soluble expression of MTB8.1 in Escherichia coli expression system was found tentatively,which laid the theoretical foundation for the industrial production.

Mycobacterium tuberculosis;protein MTB8.1;soluble expression;fermentation process;antigenicity

Q71

A

1672-2345（2014）08-0018-05

10.3969∕j.issn.1672-2345.2014.08.006

国家自然科学基金资助项目（81260456）

2014-02-24

2014-03-19

聂恒，硕士研究生，主要从事感染与免疫学研究.