美洲大蠊提取物对ISO致大鼠心肌缺血的保护作用

陆 丽，张旭强，甘 平，何 旭，陈俊雅，彭 芳*

（1.大理学院基础医学院，云南大理 671000；2.大理学院药学与化学学院，云南大理 671000）

美洲大蠊提取物对ISO致大鼠心肌缺血的保护作用

陆 丽1，张旭强2，甘 平2，何 旭2，陈俊雅2，彭 芳2*

（1.大理学院基础医学院，云南大理 671000；2.大理学院药学与化学学院，云南大理 671000）

目的：研究美洲大蠊提取物（CⅡ-3）对ISO所致大鼠心肌缺血的保护作用。方法：采用皮下注射ISO诱发大鼠心肌缺血。观察心肌缺血大鼠ECG的S-T段、Q-T间期的变化，血清中LDH、SOD、CK和MDA含量及心肌病理损伤情况。结果：3个剂量组的CⅡ-3都能降低S-T段的偏移和缩短Q-T间期（P＜0.05），中、高剂量组能显著降低MDA的含量（P＜0.01）和提高SOD的活性（P＜0.05），高剂量组能降低CK的活性（P＜0.05），但3个剂量组对LDH活性影响较小（P＞0.05）。病理检测显示3个剂量组的CⅡ-3能不同程度的减轻大鼠心肌病理组织的损伤程度。结论：CⅡ-3对ISO诱导的大鼠心肌缺血具有一定的保护作用。

美洲大蠊；心肌缺血；异丙肾上腺素

美洲大蠊（Periplaneta americana）属昆虫纲，蜚蠊目，蜚蠊科，俗称蟑螂、偷油婆等。近年来学者们对美洲大蠊进行了系列的研究，并取得一定的成果。已有学者研究表明，从美洲大蠊中提取制备的心脉隆注射液具有强心、增加心输出量及改善微循环等作用〔1-2〕，提示美洲大蠊中具有较好的心血管活性物质。本实验旨在探讨美洲大蠊另一个有效部位CⅡ-3对异丙肾上腺素（Isoprenaline，ISO）诱发大鼠心肌缺血是否有保护作用，为开发美洲大蠊系列药物提供一定的依据。

1 实验材料

1.1动物SD大鼠，雌雄各半，体重180～200 g，由中国人民解放军第三军医大学提供，合格证号：SCXK（渝）2007003。

1.2仪器1.0型高速低温离心机（德国Heraeus）；JH-C-06-04型紫外分光光度计（上海青华科技仪器有限公司）；HS21-4型数显恒温水浴锅（北京长安科学仪器厂）；BL-420E+生物机能实验系统（成都泰盟科技有限公司）。

1.3试剂与药品超氧化物歧化酶（SOD）测试盒（批号：20100816）；乳酸脱氢酶（LDH）测试盒（批号：20100720）；肌酸激酶（CK）测试盒（批号：20100723）；丙 二 醛（MDA）测试 盒（批 号：20100819），以上试剂盒均购自南京建成生物工程研究所。ISO（上海禾丰制药有限公司，生产批号：100203）；复方丹参片（北京同仁堂科技发展股份有限公司制药厂；生产批号：100128）；普萘洛尔（汕头金石制药总厂；批号：100302）。CⅡ-3由大理学院刘光明教授提供。CⅡ-3是从美洲大蠊中经特定工艺提取所得，提取物占生药的比率为0.2%。

2 实验方法

2.1实验动物分组与模型的建立取雌雄各半的SD大鼠，25%乌拉坦腹腔注射麻醉（1 g∕kg），背位固定。记录给药前大鼠正常ECG（心电图），弃去S-T段、T波有异常改变和心律失常的大鼠。将筛选后的70只大鼠，随机分为7组，即正常对照组，阴性对照组，阳性对照组（复方丹参片320 mg∕kg；普萘洛尔20 mg∕kg），CⅡ-3高、中、低剂量组（100 mg∕kg；50 mg∕kg；25 mg∕kg），每组10只。各组动物分别灌胃给药，1次∕d，连续7 d，第5天灌胃给药40 min后，除正常对照组外皮下多点注射ISO（5 mg∕kg）（皮下多点注射部位包括：四肢根部和背部共5～6点，10 s内注射完毕），连续3 d。正常对照组皮下注射等体积的生理盐水。最后一次注射ISO后，测以下各指标。2.2 ECG记录采用BL-420E+生物机能实验系统软件记录大鼠Ⅱ导联ECG 10 min。与缺血前ECG相比，以QRS复合波起点的连线作等电线观察S-T段的偏移，每次取5个心动周期的S-T段偏移值（△ST）和Q-T间期变化值（△QT），以其均数作为观测指标。以阴性对照组ST段向上或向下偏移＞0.1 mv为造模成功标准。

2.3 CK、LDH、SOD的活性以及MDA含量检测最后一次注射ISO 6 h后，各组大鼠眼球取血，4℃低温离心（3 500 r∕min），15 min，取血清，按测试盒说明测定CK、LDH、SOD和MDA的含量。

2.4组织病理检测取血后处死大鼠，立即取出心脏，用锐利刀片取左室与心尖部中点左心室前壁小块心肌（体积为2 mm×2 mm×2 mm），固定、脱水、包埋、切片、HE染色后在光学显微镜下观察大鼠心肌病理组织。

3 统计学处理

4 实验结果

阴性对照组△ST＞0.1 mv，且与正常对照组比较差异具有统计学意义（P＜0.05），说明实验造模成功。与阴性对照组比较，CⅡ-3的3个剂量组都能降低S-T段的偏移和缩短Q-T间期（P＜0.05），但无剂量依赖性；与普萘洛尔组比较，CⅡ-3中剂量的作用与普萘洛尔比较差异无统计学意义（P＞0.05）；与复方丹参片组比较，CⅡ-3中、高剂量的作用与复方丹参片比较差异无统计学意义（P＞0.05）。见表1。

表1 CⅡ-3对ISO诱导心肌缺血大鼠ECG的△QT和△ST的影响（，n=10）

表1 CⅡ-3对ISO诱导心肌缺血大鼠ECG的△QT和△ST的影响（，n=10）

注：与正常对照组比较#P＜0.05；与阴性对照组比较*P＜0.05；与普萘洛尔组比较△P＜0.05；与复方丹参片组比较&P＜0.05。

△ST∕mv 0.02±0.01*△&0.42±0.11#△&0.08±0.03*&0.17±0.02#△*0.29±0.04#△&*0.13±0.08#*0.15±0.09#*△组别正常对照组阴性对照组普萘洛尔组复方丹参片组CⅡ-3低剂量组CⅡ-3中剂量组CⅡ-3高剂量组剂量∕(mg∕kg)——20.0 320.0 25.0 50.0 100.0△QT∕ms 1.01±0.52*&12.24±2.89#△&3.80±1.02*4.99±3.54#*9.75±3.97#△&*6.80±2.54#*7.50±3.10#*△

与正常对照组比较，阴性对照组的MDA含量显著高于正常对照组（P＜0.01）；阴性对照组SOD含量显著低于正常对照组（P＜0.01）。与模型对照组比较，CⅡ-3中、高剂量组与阳性对照组一样能显著降低MDA的含量（P＜0.01）和提高SOD的含量（P＜0.05）。见表2。

表2 CⅡ-3对ISO诱导心肌缺血大鼠SOD、MDA的影响（，n=10）

表2 CⅡ-3对ISO诱导心肌缺血大鼠SOD、MDA的影响（，n=10）

注：与阴性对照组比较*P＜0.05，**P＜0.01；与正常对照组比较#P＜0.05，##P＜0.01。

SOD∕(U∕mL) 251.88±13.43**192.73±12.83##231.18±28.64*226.61±27.83*#207.38±37.85#220.28±23.05#*221.85±21.88*#组别正常对照组阴性对照组普萘洛尔组复方丹参片组CⅡ-3低剂量组CⅡ-3中剂量组CⅡ-3高剂量组剂量∕(mg∕kg)——20.0 320.0 25.0 50.0 100.0 MDA∕(nmoL∕mL) 4.24±1.92**8.48±1.99##4.57±0.84**4.40±1.05**5.38±1.22*4.92±1.68**5.08±2.06**

阴性对照组的LDH活性、CK活性显著高于正常对照组（P＜0.01）。与阴性对照组比较，CⅡ-3高剂量与阳性对照组一样能降低血清中CK的活性（P＜0.05），CⅡ-3的3个剂量略能降低LDH活性，但差异无统计学意义。见表3。

表3 CⅡ-3对ISO诱导心肌缺血大鼠血清中CK、LDH活性的影响（，n=10）

表3 CⅡ-3对ISO诱导心肌缺血大鼠血清中CK、LDH活性的影响（，n=10）

注：与阴性对照组比较*P＜0.05，**P＜0.01；与正常对照组比较#P＜0.05，##P＜0.01。

LDH∕(U∕mL) 2.68±0.74**4.19±0.59##3.39±0.65*#3.19±0.58*#3.62±0.68#3.69±0.75#3.55±0.66#组别正常对照组阴性对照组普萘洛尔组复方丹参片组CⅡ-3低剂量组CⅡ-3中剂量组CⅡ-3高剂量组剂量∕(mg∕kg)——20.0 320.0 25.0 50.0 100.0 CK∕(U∕mL) 1.12±0.18**1.62±0.31##1.34±0.29*#1.37±0.22*#1.52±0.25#1.41±0.36#1.38±0.35*#

在光学显微镜下观察，正常对照组大鼠心肌组织未见病理形态学改变。阴性对照组可见心肌纤维明显萎缩、断裂，心肌间炎症细胞浸润明显，部分心肌纤维胞浆浓缩呈凝固性坏死，部分呈溶解性坏死；阳性对照组心肌组织损伤较阴性对照组明显减轻，仅见个别或极少量炎症细胞浸润和少量心肌纤维萎缩。CⅡ-3低剂量组的心肌组织损伤较阴性对照组有所减轻，但仍可见部分心肌纤维萎缩、断裂，心肌间质炎症细胞浸润较明显；CⅡ-3中、高剂量组心肌组织损伤较阴性对照组明显减轻，只见少量炎症细胞浸润和少量心肌纤维萎缩和断裂，间质间隙变宽。见图1。

图1 心肌缺血大鼠心室病理切片图（HE，×100）

5 讨论

ISO属于人工合成的儿茶酚胺类β肾上腺素受体激动药，大剂量的ISO可激活心肌细胞β1受体，使心脏过度兴奋，心肌耗氧量增加；同时激活β2受体，使冠状动脉扩张，冠脉压力下降，从而导致心肌缺血、缺氧，进而引起心肌细胞损伤，造成心肌细胞膜内外离子成分及其浓度改变，从而影响心肌细胞的极化状态和除极、复极程序，反映在ECG上表现为心电图的改变〔3〕。ISO所诱导的大鼠心肌缺血损伤模型的缺血损伤的渐进性及心肌酶学变化均类似于人类急性心肌梗死的病变特征，所以此模型是评价心肌保护药常用的心肌缺血损伤模型之一，已有30余年的历史，该模型简便、稳定，便于观察急性心肌缺血大鼠的ECG变化〔4〕。

心肌缺血ECG的改变其病理学基础是心肌的血液供应障碍，由于心肌血液微循环障碍的程度不同，ECG分别表现为S-T段呈弓背型抬高、T波倒置，病理性Q波。实验结果显示，与阴性对照组比较CⅡ-3（25，50，100 mg∕kg）能降低S-T段的偏移和缩短Q-T间期（P＜0.05），提示CⅡ-3具有防治或减轻心肌损伤，改善缺血缺氧状态，保护心肌细胞的作用。

当心肌细胞缺血受损，细胞膜通透性增加，细胞内LDH和CK外漏致血中LDH和CK升高，所以血清中LDH、CK活性可以间接反映心肌损伤程度变化。特别是CK在各种病变包括肌肉萎缩和心肌梗塞发生时，血清中CK水平迅速提高。心肌梗死时，CK在发病6 h内升高，24 h达高峰，3～4日内恢复正常，因此CK的变化是临床诊断患者患有心肌缺血性损伤的重要参考指标〔5〕。实验结果显示，CⅡ-3（100 mg∕kg）与普萘洛尔、复方丹参片一样能降低血清中CK的活性（P＜0.05），说明一定浓度的CⅡ-3可以稳定心肌细胞膜，对心肌缺血损伤有一定的保护作用。试验中还发现3个剂量的CⅡ-3略能降低血清中LDH活性，但差异没有统计学意义，其原因可能是LDH广泛分布在心肌、骨骼肌和肝脏中，当ISO导致大鼠心肌缺血的同时也损伤了其它组织器官，进而使大鼠血清中LDH的活性大大增强，而一定量的CⅡ-3不能完全抵抗LDH的这种活性。

心肌缺血时心肌病理形态学发生改变，可见心肌间炎症细胞浸润明显，心肌纤维胞浆浓缩呈凝固性或溶解性坏死。实验结果显示：CⅡ-3组大鼠的心肌组织损伤较阴性对照组明显减轻，只见少量炎症细胞浸润和心肌纤维萎缩、断裂。说明CⅡ-3可以改善心肌病理损伤程度。

心肌缺血时产生大量的氧自由基，氧自由基是一类具有高度化学反应活性的含氧基团，是机体内氧分子的不完全代谢产物。它可聚集在体表、心脏、血管、肝脏和脑细胞中，它能与各种细胞成分发生反应，造成细胞膜的损伤或细胞的死亡。如果沉积在血管壁上，会使血管发生纤维性病变，导致动脉管硬化、高血压、心肌梗塞等，是造成人类衰老和疾病的元凶。SOD是需氧生物体内的一种含金属离子的酶蛋白，它是机体清除氧自由基的重要酶类，它的活性的高低间接地反映了机体清除自由基的能力。当心肌受损时，SOD活性降低，含双键的脂肪酸过氧化生成MDA，MDA可使膜成分之间发生交联和聚合，从而使膜的变构、离子传递、酶活性等发生改变〔6-11〕。因此MDA的含量高低可间接反映心肌细胞受氧自由基攻击的严重程度。实验结果发现：CⅡ-3（50，100 mg∕kg）与普萘洛尔、复方丹参片一样能显著降低血清中MDA的含量和提高血清中SOD的活性，说明CⅡ-3可以提高机体清除氧自由基的能力，抑制脂质过氧化过程，减少脂质过氧化物对心肌的损伤。

本实验表明，CⅡ-3对ISO诱导的心肌缺血大鼠具有一定的保护作用，其具体的作用机制还有待进一步研究。

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*通信作者：彭芳，教授.

（责任编辑 李 杨）

Protective Effect of Periplaneta americana Extracts on Myocardial Ischemia Induced by Isoproterenol in Rats

LU Li1,ZHANG Xuqiang2,GAN Ping2,HE Xu2,CHEN Junya2,PENG Fang2*
（1.Pre-clinical College,Dali University,Dali,Yunnan 671000,China;2.College of Pharmacy and Chemistry,Dali University,Dali,Yunnan 671000,China）

Objective:To study the protective effect of CⅡ-3 extracted from Periplaneta americana on myocardial ischemia in rats induced by isoproterenol(ISO).Methods:The myocardial ischemia model was made by using subcutaneous injection of ISO in rats. The change of S-T segment and Q-T interval of electrocardiogram(ECG)was observed,and the content of LDH,CK,SOD and MDA in serum was measured.The pathological lesion of myocardium were observed.Results:Three types of dosage of CⅡ-3（low,25 mg∕kg; mid,50 mg∕kg;high,100 mg∕kg）all significantly reduced S-T segment deviation and shortened Q-T interval(P＜0.05).Middle and high dosage of CⅡ-3 significantly reduced the content of MDA(P＜0.01)and raised the activity of SOD(P＜0.05).High dosage of CⅡ-3 reduced the activity of CK(P＜0.05),but three dosage of CⅡ-3 had the subtle effect on the activity of LDH. Pathological examination showed that three dosages of CⅡ-3 could reduce the pathological lesion of myocardium in rats to varying degrees.Conclusion:CⅡ-3 had some protective effect on myocardial ischemia in rats induced by ISO.

Periplaneta americana;myocardial ischemia;isoproterenol

R285.5

A

1672-2345（2014）08-0007-04

10.3969∕j.issn.1672-2345.2014.08.003

2014-04-04

2014-05-12

陆丽，助理实验师，主要从事机能学教学研究.