硫化氢对大鼠心肺复苏后心肌细胞凋亡的影响

2014-02-10 08:27谢学猛潘昊刘蓓蓓陈娣张锦程杨光田
中华急诊医学杂志 2014年1期
关键词:凋亡心肺复苏硫化氢

谢学猛 潘昊 刘蓓蓓 陈娣 张锦程 杨光田

【摘要】目的 研究外源性硫化氢(H2S)对心肺复苏后大鼠心肌细胞凋亡的影响。方法 雄性SD大鼠45只,随机(随机数字法)分3组,每组15只:假手术对照组(Sham);常规复苏组(CPR),经皮电刺激心外膜法制备心搏骤停模型,行常规复苏; 硫氢化钠组(NaHS),以NaHS为H2S供体,CPR开始前1 min静脉给药(总剂量5 mg/kg),其余操作同CPR组。记录三组大鼠血流动力学指标变化。24 h后取左室心肌组织TUNEL法检测心肌细胞凋亡;RT-PCR法检测Caspase-3、Bax和Bcl-2基因表达;ELISA法检测血浆肌钙蛋白T含量。三组数据采用单因素方差分析,组间比较采用SNK-q检验。结果 与CPR组比较, NaHS组LVSP、+dp/dtmax、-dp/dtmax增高(P<0,01),肌钙蛋白T含量降低(P<0,05),心肌TUNEL阳性细胞比例降低(P<0,01)。与Sham组比较,CPR组和NaHS组心肌组织Caspase-3、Bax、Bcl-2基因表达不同程度增高(P<0,01);与CPR组相比,NaHS组Caspase-3、Bax基因表达降低(P<0,01),Bcl-2基因表达增高(P<0,05)。结论 外源性H2S在心肺复苏后24 h调节大鼠心肌Caspase-3、Bax和Bcl-2基因表达,减轻心肌细胞凋亡,减少心肌标志物释放,改善心功能。

【关键词】心肺复苏;心功能障碍;硫化氢;凋亡

Effects of hydrogen sulfide on apoptosis of cardiomyocytes after cardiopulmonary resuscitation in a rat model Xie Xuemeng,Pan Hao,Liu Beibei,Chen Di, Zhang Jincheng, Yang Guangtian. Emergency Department, Tongji Hospital, Tongji Medical College, Huazhong University of Science and Technology, Wuhan 430030, China

Corresponding author: Yang Guangtian, Email: guangtiany@hotmail,com

【Abstract】Objective To explore the effects of hydrogen sulfide ( H2S)on apoptosis of cardiomyocytes after cardiopulmonary resuscitation (CPR) in rat models.Methods Forty-five male SD rats were randomly into sham group (n=l5), CPR group (n=15) and NaHS group (n=15). Rats of CPR group and NaHS group were operated to induce cardiac arrest by transcutaneous electrical stimulation to epicardium. In NaHS group, NaHS (5 mg/kg) was administrated via the femoral venous line 1 min before CPR. Hemodynamic variables were monitored and obtained continuously. Survival rats were sacrificed at 24 h after restoration of spontaneous circulation and the hearts were removed for analysis by RT-PCR and TUNEL assays. Blood samples were collected and plasma content of cTnT was detected.Results Compared with the CPR group, animals treated with NaHS had improved left ventricular function(P<0,01), lower plasma cTnT levels(P<0,05)and decreased apoptosis index (P<0,01)24 h after ROSC. The expressions of Caspase-3 mRNA, Bax mRNA and Bcl-2 mRNA in CPR group and NaHS group were higher compared with the control group(P<0,01). The NaHS group had lower expressions of Caspase-3 mRNA and Bax mRNA(P<0,01), but higher expression of Bcl-2 mRNA(P<0,05)compared with the CPR group. Conclusions Exogenous (H2S) regulated the expressions of Caspase-3,Bax and Bcl-2 mRNA, thereby preventing apoptosis of cardiomyocytes, inhibiting cTnT release and improving left ventricular function 24 h after CPR.

【Key words】Cardiopulmonary resuscitation; Myocardial dysfunction; Hydrogen sulfide; Apoptosis

随着心肺复苏(CPR)技术的发展,心搏骤停(CA)患者自主循环恢复(ROSC)率已达20%~40%,但仍有50%~70%的ROSC患者在住院期间死亡[1-2]。复苏后心功能不全是导致患者院内死亡的重要原因[3]。据报道,约30%的患者在复苏成功后24 h内死于室性心律失常或心力衰竭[4]。

研究发现,新型气体信号分子硫化氢(hydrogen sulfide, H2S)能够减轻小鼠CA/CPR所致心肌损伤及心功能障碍[5]。笔者先前的研究也证实,H2S能够提高心肌细胞缺氧耐受、减轻炎症反应,从而减轻复苏后大鼠心肌损伤[6],但是其保护作用与心肌细胞凋亡的关系尚不清楚。因此,本实验通过建立大鼠心肺复苏模型,观察心肌细胞凋亡变化及外源性H2S的干预作用,旨在探讨H2S能否够通过调控凋亡发挥心肌保护作用。

1 材料与方法

1,1 实验仪器及试剂

RM6240BD型多通道生理信号采集处理系统、HX-300小动物呼吸机(以上均购自成都泰盟科技有限公司)、PCR仪(eppendorf)、硫氢化钠(sigma)、大鼠肌钙蛋白T检测试剂盒(abcam)、EasyTaq PCR SuperMix(北京全式金生物技术有限公司)及TUNEL细胞凋亡检测试剂盒(南京凯基生物科技发展有限公司)。

1,2 方法

1,2,1 动物及分组 健康成年雄性SD大鼠45只,体质量300~400 g,由华中科技大学同济医学院实验动物中心提供。术前12 h禁食禁水,腹腔注射苯巴比妥钠(45 mg/kg)麻醉,持续Ⅱ导连心电监测。经口气管插管,左侧股动、静脉分别置PE50导管用于血压监测和静脉给药。持续监测肛门温度,加热灯泡使之维持在(36,5±0,5) ℃。动物随机(随机数字法)分为三组,每组15只:(1)假手术对照组(Sham),仅行麻醉和插管操作;(2)常规复苏组(CPR),建立大鼠心搏骤停模型,行常规复苏,予0,9%NaCl溶液静脉输注(16,6 mL/kg);(3)NaHS组,以NaHS(0,3 mg/mL)为H2S供体,总剂量5 mg/kg,CPR开始前1 min经股静脉予首剂量(0,5 mg/kg),后使用微量注射器泵入(1,5 mg·kg-1·h-1,×3 h),其余操作同CPR组。

1,2,2 CPR模型制备 经皮电刺激心外膜法建立大鼠心搏骤停模型[7]。分别于左侧第三、右侧第四肋间紧贴胸骨处经皮插入针灸针至心外膜,连接电极。电击(直流电,2 mA起)开始后,大鼠血压迅速降至25 mmHg (1 mmHg=0,133 kPa)以下,随后出现呼吸停止、肢体抽搐等心搏骤停表现。持续电击3 min防止大鼠自动除颤,停止电击后心电图可见室颤或无脉性电活动表现,无干预观察3 min后开始抢救。胸外按压采用自主研制的心肺复苏机,按压频率200次/min,机械通气(空气)100次/min,潮气量6 mL/kg。肾上腺素(20 μg/kg)每5 min使用一次。自主循环恢复(ROSC)定义为:心电恢复规则节律、MAP≥60 mmHg并持续10 min以上。按压持续10 min自主循环未恢复视为复苏失败。注射完毕将动物缝合后放置笼中。

1,3 观察指标

1,3,1 血流动力学指标 平均动脉压、心率可由生理信号采集处理系统采集。复苏后24 h,右侧颈总动脉插管记录LVSP、+dp/dtmax和-dp/dtmax等心功能指标。

1,3,2 心肌TUNEL染色及凋亡分析 术后24 h取左心室壁心肌组织,4%多聚甲醛常温固定包埋,切片、脱蜡,其余步骤按照说明书进行。显微镜下采集图像,凋亡细胞细胞核显色为棕褐色。每张切片随机取 5个高倍镜(400×)视野,分别计数阳性细胞核个数和细胞核总数,两者比值定义为该切片凋亡指数。

1,3,3 心肌组织凋亡相关基因RT-PCR分析 Trizol法提取心肌组织总RNA,逆转录采用Fermentas试剂盒按照说明书进行。PCR扩增条件:(1)预变性,94 ℃ 10 min;(2)变性,94 ℃ 30 s;(3)退火,Bax基因64 ℃,其余58 ℃ 30 s;(4)延伸,72 ℃ 45 s;(5)充分延伸,72 ℃ 10 min。其中Bax基因扩增33个循环,其余基因皆为30个循环。引物序列见表1。PCR完成后行2%琼脂糖凝胶电泳,照相后用Quantity one软件灰度分析,以目的基因与β-actin基因的扩增产物条带灰度值之比作为反映目的基因mRNA水平的相对指标。

1,3,4 血清肌钙蛋白T含量测定 所有动物术后24 h于心尖处抽取动脉血,使用大鼠肌钙蛋白T检测试剂盒(双抗夹心法),按照说明书进行。

1,4 统计学方法

采用SPSS 12,0软件包进行统计学分析。所有计量资料以均数±标准差(x±s)表示,采用单因素方差分析,组间两两比较采用SNK-q检验,以P<0,05为差异具有统计学意义。

2 结果

2,1 各组大鼠一般情况及复苏条件

各组大鼠一般情况和复苏条件差异无统计学意义(P>0,05),见表2。CPR组和NaHS组分别有11只和12只大鼠复苏成功,24 h后CPR组有10只存活,NaHS组全部存活。

2,2 ROSC后血流动力学参数比较

ROSC后3 h内CPR组和NaHS组的血压和心率差异无统计学意义(P>0,05),见图1。ROSC后24 h,NaHS组心功能指标LVSP、+dp/dtmax和-dp/dtmax指标皆高于CPR组(P<0,01)(表3)。

2,3 血清肌钙蛋白T质量浓度测定

24 h后CPR组和NaHS组血浆肌钙蛋白T高于对照组(P<0,01),而NaHS组水平低于CPR组(P<0,05),见表3。

2,4 心肌TUNEL染色及凋亡分析

与对照组相比,CPR组和NaHS组TUNEL阳性细胞比例增高(P<0,01),NaHS组阳性心肌细胞比例则低于CPR组(P<0,01)。见图2、图3。

2,5 心肌组织凋亡相关基因RT-PCR分析

对照组仅有少量Caspase-3、Bax和Bcl-2表达。CPR组和NaHS组三种基因的表达量均增加(P<0,01)。与CPR组比较,NaHS组的Caspase-3、Bax表达降低(P<0,01),而Bcl-2表达升高(P<0,05)。见图4、图5。

3 讨论

心肌是CA/CPR后缺血-再灌注损伤的主要靶器官之一,心肺复苏后多有低血压、心律失常和低心输出量等表现。在本研究中,CPR组和NaHS组动物复苏后平均动脉压和心率明显降低,ROSC后24 h血浆肌钙蛋白T含量升高、心功能指标下降,这表明两组大鼠在经历CA/CPR后皆出现了明显的心肌损伤和心肌功能障碍。ROSC后24 h,NaHS组血浆肌钙蛋白T明显低于CPR组,而 LVSP、+dp/dtmax、-dp/dtmax等心功能指标明显优于CPR组,证实了H2S对CA/CPR后大鼠心肌的保护作用。

目前已有多项研究发现复苏后心肌组织中细胞凋亡及其相关因子表达的变化[8-10]。本研究在ROSC后24 h心肌细胞TUNEL凋亡检测中观察到大量阳性细胞,再一次证实凋亡参与复苏后心肌功能障碍的病理生理过程。心肌细胞是人体的永久细胞,一旦凋亡将不能再生。据报道,慢性心力衰竭、急性心肌缺血等多种疾病都有心肌细胞凋亡发生并影响心脏泵血功能[11],而凋亡潜在的可逆性也为这些疾病的治疗提供了新的方向。

新型气体信号分子H2S在心肌缺血-再灌注损伤中的作用已被广泛证实[12-13]。H2S具有抗氧化、保护线粒体、调节炎症反应等多种活性[14-15],可以影响凋亡启动和进展的多个环节,还可从整体上降低代谢率、提高缺氧耐受[16],并在心肌缺血后适应中扮演重要角色[17]。因此,笔者推测,在心搏骤停后、CPR之前给予H2S供体NaHS可能减轻大鼠复苏后心肌细胞凋亡。本研究结果显示,NaHS组心肌细胞凋亡指数明显低于CPR组,从而证实H2S可以在复苏后24 h通过减轻心肌细胞凋亡而发挥心肌保护作用。

Caspase-3是细胞凋亡的主要执行者,其基因表达水平在CPR组和NaHS组明显升高,表明复苏后心肌细胞凋亡与Caspase-3基因上调相关。另有研究显示,在不完全凋亡的情况下,激活的Caspase-3能够降解心肌细胞内的多种结构和功能蛋白[18-19],损伤心肌细胞收缩功能。本研究发现,NaHS组Caspase-3基因表达相比CPR组明显降低,这提示H2S的抗凋亡作用可能与下调的Caspase-3有关,该效应可同时减少心肌结构蛋白分解,保护心肌收缩功能。

Bcl-2和Bax是Bcl-2基因家族中功能相反的两个重要成员。当线粒体基质中的Bax与线粒体膜上的离子通道结合可引起线粒体通透性增加,促进凋亡发生。而锚定在线粒体外膜上的Bcl-2可与Bax结合致使后者活化受阻、抑制凋亡[20]。笔者观察到,正常大鼠心肌组织内Bcl-2和Bax表达量很少,而在复苏后大鼠的心肌组织内二者的表达量皆升高。NaHS组Bax表达明显低于CPR组,Bcl-2表达则明显提高。这表明,H2S的抗凋亡作用与其调节Bcl-2、Bax表达水平有关。

综上所述,心肺复苏后大鼠心肌细胞凋亡明显增加,给予外源性H2S可以调节心肌组织 Caspase-3、Bax和Bcl-2基因表达,减轻心肌细胞凋亡,减少心肌标志物释放,从而减轻复苏后心肌损伤。

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(收稿日期:2013-04-23)

(本文编辑:邵菊芳)

DOI:10,3760/cma,j,issn,1671-0282,2014,01,006

基金项目:国家自然科学基金(81071526)

作者单位:430030 武汉,华中科技大学同济医学院附属同济医院急诊科

通信作者:杨光田,Email: guangtiany@ hotmail,com

P19-23

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