四种乳酸菌组合在豆乳饮料中的发酵研究

王孝研，李妍，柳羽丰

（黑龙江省质量监督检测研究院，黑龙江哈尔滨150050）

四种乳酸菌组合在豆乳饮料中的发酵研究

王孝研，李妍，柳羽丰

（黑龙江省质量监督检测研究院，黑龙江哈尔滨150050）

采用干酪乳杆菌、嗜酸乳杆菌、保加利亚乳杆菌和瑞士乳杆菌4种乳酸菌纯种发酵与不同的菌种组合在豆乳饮料中的发酵的研究，并通过pH值、酸度值和感官品质确定适宜的乳酸菌混种发酵配比。结果表明干酪乳杆菌分别与瑞士乳杆菌、嗜酸乳杆菌和保加利亚乳杆菌组合在纯豆乳饮料生长产酸能力相当；应用干酪乳杆菌、瑞士乳杆菌、保加利亚乳杆菌与嗜酸乳杆菌，配比依次为6∶1.5∶1∶1时，较其他组合有明显提高。发酵生成的大豆酸乳酸度适宜、发酵速度最快、酸乳饮料组织形态均匀、香味丰富柔和。

大豆；发酵豆乳饮料；乳酸菌；豆乳饮料

发酵豆乳饮料具有独特的风味，酸甜适度，芳香可口，营养丰富，含有多种对人体有益的乳酸菌，因而深受广大消费者的青睐。豆乳饮料经发酵后既能发挥大豆的营养功能，又能消除豆乳饮料中的抗营养因子[1]，使大豆蛋白质的消化率得到明显提高，是一种集大豆营养与乳酸菌功效于一体的新型保健产品。传统发酵乳中常用的保加利亚乳杆菌和嗜热链球菌对胃酸和胆汁非常敏感，难以到达肠道[2]。而嗜酸乳杆菌耐酸和胆盐的能力较强，能在肠道内定殖。同时具有优良的保健功能，因此，更符合人们对健康的需求。而以豆乳饮料为原料加工发酵乳，成本更为低廉，且豆乳饮料中含有促进益生菌生长的增殖因子，能够一定程度上缩短发酵时间，克服嗜酸乳杆菌在发酵乳中生长较差的缺点[3]。

选择适宜发酵豆乳饮料的菌种，国内对大豆酸奶的研究所用的乳酸菌主要是保加利亚乳杆菌和嗜热链球菌，也有部分人加入了双歧杆菌、鼠李糖乳杆菌、嗜酸乳杆菌等益生菌研究发酵大豆酸奶的，但是总的来看，用益生菌发酵大豆酸奶的研究比较少，而且研究也不够深入。发酵豆乳饮料的制备通常按照发酵纯牛乳的工艺，通过改变菌种及发酵条件等进行改进。

1 实验部分

1.1 材料

1.1.1 原料与试剂

大豆、鲜牛乳，市售，产地黑龙江。

脱脂乳粉（蛋白质含量36.4%），产自新西兰。酚酞、乙醇、NaOH，均为分析纯。

1.1.2 菌种

瑞士乳杆菌（Lactobacillus helveticus LH-B02，简写为LH-B02）：丹麦汉森（Hansen’s公司）；干酪乳杆菌（Lactobacillus casei，简写为L.casei)（东北农业大学食品学院微生物实验室）；嗜酸乳杆菌（L. acidophilus，简写为L.a）（东北农业大学食品学院微生物实验室）；保加利亚乳杆菌（L.bulgaricus，简写为L.b）（东北农业大学食品学院微生物实验室）。

1.1.3 培养基菌株保存与传代培养基为：12%脱脂乳经115℃灭菌10min，冷却至40℃后接种，接种量为10%，于37℃培养12～24h，凝乳后置4℃冰箱中保存。

鉴定及计数培养基为：MRS琼脂培养基（北京陆桥责任有限公司）；MC琼脂培养基（北京陆桥责任有限公司）；TPY琼脂培养基（北京陆桥责任有限公司）。

1.1.4 仪器与设备DJ12B-A11D豆浆机（九阳股份有限公司）；SW-CJ-1FD型无菌操作台（苏州安泰空气技术有限公司）；YXQ-SG46-280S型手提式高压灭菌锅（合肥华泰医疗设备有限公司）；增力电动搅拌器（江苏省金坛市金城国盛仪器有限公司）；HWS-24电热恒温水浴锅（上海齐欣科学仪器有限公司）；TDZ4台式自动平衡离心机（长沙平凡仪器仪表有限公司）；PHS-3C精密pH计（上海市雷磁仪器厂）；电子分析天平（北京市仪器二厂）；微量取液器（北京青云航空仪器有限公司）；电热恒温培养箱（上海齐欣科学仪器有限公司）；电热干燥箱（天津泰斯特责任有限公司）。

1.2 实验方法

采用干酪乳杆菌、瑞士乳杆菌、保加利亚乳杆菌和嗜酸乳杆菌4种菌株，利用豆乳饮料最适发酵原料进行发酵。分别采用单菌种发酵、多菌种发酵两种方式，测定乳酸菌发酵豆乳饮料的pH值及酸度并进行感官评价。确定一株主发酵菌株后与其他3株乳酸菌组合，进行多菌种发酵，并确定该方式的最适菌种配比，进行后续实验。设置3个平行，混匀后42℃静止培养5～6h后取出，4℃后熟24h。

1.2.1 酸度的测定以乳酸（%）为酸度测定指标进行测定分析。吸取10mL发酵豆乳饮料置于250mL三角瓶中，加入40mL新沸放冷的蒸馏水，再加入0.5 mL0.5%酚酞乙醇溶液，振荡混匀，用0.1mol·L-1NaOH标准溶液滴定至微红色，30s不褪色即为终点，记录消耗NaOH标准溶液的体积（mL），乘以10即得发酵豆乳饮料的酸度（0T）。如果NaOH标准溶液浓度不为0.1mol·L-1，则需要进行浓度换算。

酸度=[V1（NaOH）-V0（NaOH）]×10

式中V1（NaOH）：滴定至终点后NaOH标准溶液的体积读数，mL；V0（NaOH）：滴定起点处NaOH标准溶液的体积读数，m L。

1.2.2 pH值的测定将发酵好的豆乳饮料从4℃冰箱中取出，振荡混匀后，用pH计测定样品的pH值，按QB/T 1803执行。

1.2.3 发酵豆乳饮料的感官评价与描述选取15名接受过专业技术培训的感官评价员，感官要求，以色泽、气味、口感和组织形态为指标对最适发酵工艺获得的乳酸菌发酵豆乳饮料进行感官评价。各项评价内容分别以两个感官性状描述词代表两个极端（表1中第2、4两行），由感官评价员给予打分。各项总计100分，相应等级包括：100～85分为“好”，85～60分为“一般”，<60分为“差”。具体评价内容见表1。

表1 发酵豆乳饮料感官评价表Tab.1 Item and index in sense evaluation of lactobacillus fermented soy yogurt by soybeans.

2 结果与分析

2.1 单菌种发酵

分别采用瑞士乳杆菌、干酪乳杆菌、嗜酸乳杆菌和保加利亚乳杆菌4种益生菌进行单菌种发酵，为考察豆乳饮料中各菌生长产酸情况，将各菌分别接种于纯豆乳饮料、纯牛乳与混合豆乳饮料中，感官评价发现以混合豆乳饮料为原料，经各菌株单菌种发酵感官品质差异微小。pH值与酸度值比较结果见表2。

表2 单菌种发酵豆乳饮料的pH值和酸度值Tab.2 Effectof four single strines on the pH value and titratable acidity of soy-based yogurt

结果表明，瑞士乳杆菌在混合乳中产酸能力很强，但在纯豆乳饮料中产酸能力不够强，生长不够好，干酪乳杆菌在纯豆乳饮料中生长产酸能力比瑞士乳杆菌强，研究还得出，纯种发酵中干酪乳杆菌发酵生成酸度最快，因此，以干酪乳杆菌为主发酵菌。

2.2 多菌种发酵

以干酪乳杆菌为主发酵菌，分别与瑞士乳杆菌、嗜酸乳杆菌和保加利亚乳杆菌3种益生菌组合发酵，按表3所列比例进行组合。

表3 多菌种组合编号与详情（%）Tab.3 Combinition number and lactobacillus ofmultiple strines

将各组合菌种分别接种于2.2确定的发酵原料（混合豆乳饮料）中，进行多菌种发酵，测定其pH值与酸度值，并进行感官评价，结果分别见表4、5。

表4 乳酸菌多菌种发酵豆乳饮料的感官评价结果Tab.4 Comparison of sense evaluation of soy yogurtmade by four different single strines

结果表明，经多菌株发酵，色泽与组织形态指标未见明显差别，口感指标中组合1-1、1-2、2-1、2-2、2-3差异微小，组合1-3与3-1明显优于其他组合，但组合1-3气味质标不如组合3-1。气味指标中组合1-1、1-2、1-3、2-1、2-2差异微小，组合2-3与3-1明显优于其他组合。感官评价总分组合2-3与3-1较高。

表5 多菌种发酵豆乳饮料的pH值和酸度值Tab.5 Effectofmutiple strines on the pH value and titratable acidity of soy-based Yogurt

结果表明，混种发酵较纯种发酵大豆乳饮料酸度上升更快、香味更为丰富，干酪乳杆菌分别与瑞士乳杆菌、嗜酸乳杆菌和保加利亚乳杆菌组合在豆乳饮料中生长产酸能力相当；应用干酪乳杆菌、保加利亚乳杆菌、嗜酸乳杆菌这一组合发酵剂（组合3-1）制备的产品在理化与感官指标上均最佳。

2.3 菌种配比的优化

针对4菌组合发酵，即干酪乳杆菌为主发酵菌、瑞士乳植菌、保加利亚乳杆菌、嗜酸乳杆菌四菌组合发酵，设计三因素三水平正交实验，以酸度值为指标，对其配比进行优化实验，正交实验的因素水平与直观分析见表6。

由表6正交实验结果可知，干酪乳杆菌为主发酵菌、瑞士乳植菌、保加利亚乳杆菌、嗜酸乳杆菌对发酵豆乳饮料的酸度值影响程度依次为：A>B>D>C，即干酪乳杆菌>瑞士乳植菌>嗜酸乳杆菌>保加利亚乳杆菌，其中，干酪乳杆菌与瑞士乳植菌的比例变化对发酵豆乳饮料酸度值影响程度接近，并明显超过保加利亚乳杆菌和嗜酸乳杆菌的影响程度。最佳菌种配比组合为A3B3C2D2，干酪乳杆菌、瑞士乳植菌、嗜酸乳杆菌、保加利亚乳杆菌的菌种比例依次为：60%∶15%∶10%∶10%（6∶1.5∶1∶1）。

经验证实验，4种乳酸菌配比依次为6∶1.5∶1∶1时，酸度值可达117.1 oT，较其他组合有明显提高。发酵生成的大豆酸乳酸度适宜、发酵时间最短、酸乳饮料组织形态均匀、香味丰富柔和。应用该比例进行豆乳饮料发酵工艺的研究。

表6 正交实验直观分析表Tab.6 Orthogonal experimental design and analysis

3 结论

分别采用瑞士乳杆菌、干酪乳杆菌、嗜酸乳杆菌和保加利亚乳杆菌4种益生菌进行单菌种发酵，瑞士乳杆菌在混合乳中产酸能力很强，但在纯豆乳饮料中产酸能力不够强，生长不够好，干酪乳杆菌在纯豆乳饮料中生长产酸能力比瑞士乳杆菌强，研究还得出，纯种发酵中干酪乳杆菌发酵生成酸度最快，这可能由于干酪乳杆菌中富含的酶类与大豆蛋白酶切位点相符合的程度高于其他3种乳酸菌，因此，对大豆蛋白的利用率较高，产酸速度较快。

干酪乳杆菌为主发酵菌、瑞士乳植菌、保加利亚乳杆菌、嗜酸乳杆菌4菌组合发酵，较纯种发酵大豆乳饮料酸度上升更快、香味更为丰富，制备的产品在理化与感官指标上均最佳。分析原因是，在主发酵菌干酪乳杆菌决定了发酵豆乳饮料整体品质的前提下，添加保加利亚乳杆菌、嗜酸乳杆菌、瑞士乳植菌三菌，可以弥补干酪乳杆菌在利用大豆蛋白产香上的限制，起到增香和提高口感的效果。多菌种复合发酵，综合了4种乳酸菌的益生作用与优势。

针对干酪乳杆菌、嗜酸乳杆菌、保加利亚乳杆菌和瑞士乳杆菌3种乳酸菌纯种发酵与不同的菌种组合在豆乳饮料中的发酵情况，确定最优菌种配比为干酪乳杆菌、瑞士乳杆菌、保加利亚乳杆菌与嗜酸乳杆菌依次为6∶1.5∶1∶1，发酵生成的大豆酸乳酸度适宜、发酵时间最短、酸乳饮料组织形态均匀、香味丰富柔和。

［1］Nakazawa Y.,Functions of fermentedmilks:Challenges for thehealth sciences［M］.London:ElsevierScience,1992.289-304.

［2］Paseephol T.,Small D.M.,Sherkat F.,Rheology and Texture of Set Yogurtas Affected by Inulin Addition［J］.Journal of Texture Studies,2008,39（6）:617-634.

［3］Potter，S.M.et al.Soybean protein concentrate and isolated soybean protein similarly lower blood serum cholesterolbutdifferently affect thyroid hormonesin hamster［J］.J.Nutr.1996，126（8）:2007-2011.

Study on ferm entation of four lactobacillus combination in soybean m ilk

WANG Xiao-yan,LIYan,LIU Yu-feng
（Academy of Quality Inspection and Research in Heilongjiang Province,Harbin 150050,China）

s：The fermentation of four lactobacillus of lactobacillus casei,lactobacillus acidophilus,Bulgarian lactobacillus and lactobacillus helveticus with different strains combination in the soybean milk were studied.The optimal proportioning for lactobacillus interbreeds of pH value,acid value and sensory qualities were determined. The results showed that growth abilities were equal of the combination of lactobacillus caseiwith lactobacillus acidophilus,Bulgarian lactobacillus and lactobacillus helveticus.The ratio of lactobacillus casei,lactobacillus helveticus and Bulgarian lactobacilluswith lactobacillus acidophilus were 6∶1.5∶1∶1,it showed better growth abilities.The lactococcuswere proper acid,fast fermentation rate,soft texture and rich flavor.

soy bean；soy yogurt；lactobacillus；soybeanmilk beverage

Q939.11

A

1002-1124（2014）07-0073-04

2014-05-10

王孝研（1981-），男，硕士研究生，工程师，主要从事食品和化工产品检测。