NFKB1基因启动子区-94ins/del ATTG多态性在新疆汉族和维吾尔族及哈萨克族人群中的分布特征及其与血脂的关系

董星辉，李晓梅，杨毅宁，马依彤，谢 翔，张金宇

核因子Kappa B(NF-κB)是一组具有重要转录调节作用的蛋白质，能与许多细胞因子、黏附因子等基因启动子或增强子部位κB位点发生特异性结合，启动和调节基因转录，在多种急慢性炎症性疾病、肿瘤和变态反应性疾病发生、发展中发挥重要作用[1-2]。人类NF-κB主要由p50及p65异源二聚体组成，分别由NFKB1及RelA基因编码。近年来，NFKB1基因的遗传多态性及其与疾病的易患性关系受到广泛关注，NFKB1基因启动子区-94ins/del ATTG基因多态性与多种心血管疾病及肿瘤性疾病相关。del等位基因可能增加高加索人群患冠心病的风险[3]，并加快心力衰竭早期患者心功能恶化的进程[4]，携带不同基因型的糖尿病患者摄入多不饱和脂肪酸后血浆高密度脂蛋白胆固醇(HDL-C)水平升高的程度不同[5]。而有关该基因多态性与肿瘤疾病易患性的研究表明，该基因多态性在地区及民族分布中有较大差异性，不同地区及不同民族该位点多态性对疾病的易患性不同[6-8]。新疆是一个多民族地区，不同民族在冠心病、高血压、高脂血症等患病率上存在较大差异[9-10]，而关于NFKB1基因启动子区-94ins/del ATTG多态性在中国新疆汉族、维吾尔族及哈萨克族人群中分布频率尚无报道。本研究旨在探讨新疆地区汉族、维吾尔族及哈萨克族人群NFKB1基因启动子区-94ins/del ATTG多态性分布特征的差异，并比较各异常血脂与正常血脂基因型分布差异，为今后研究基因NFKB1启动子区-94ins/del ATTG多态性与心血管疾病的相关性提供帮助。

1 对象与方法

1.1 纳入与排除标准 纳入标准：(1)年龄35～65岁；(2)受试者间无直接血缘关系；(3)经详细的病史调查、体格检查、心电图、心脏超声、血糖及肾功能等检测未见异常。排除标准：(1)正在服用降血脂药物者；(2)既往有冠心病、糖尿病、肾病综合征、急性肝炎、甲状腺功能异常等影响血脂代谢的疾病病史者；(3)实时荧光定量PCR仪无法自动分型者。

1.2 研究对象 采用整群随机抽样方法，于2008—2010年选择新疆乌鲁木齐、福海、吐鲁番、伊犁、克拉玛依、和田、阜康7个地区共26个乡镇，选取汉族604名、维吾尔族585名及哈萨克族566名，受试者均已签署知情同意书。

1.3 试剂与仪器 血液基因组DNA提取试剂盒购自天根生化科技(北京)有限公司；实时荧光定量PCR仪7900HT、SNP、Master mix、光学96孔板、封板膜购自美国应用生物系统公司；低速离心机购自安徽中科中佳科学仪器有限公司，型号SC-3610。

1.4 基本资料收集及血生化指标的测定 受试者身高、体质量安排专人测量，计算体质指数(BMI)，并记录吸烟、饮酒情况；血清总胆固醇(TC)、三酰甘油(TG)、低密度脂蛋白胆固醇(LDL-C)、HDL-C、血清葡萄糖(Glu)均由新疆医科大学第一附属医院检验中心统一测定。

1.5 基因组DNA提取 受试者均禁食约12 h后，采集外周静脉血3 ml，乙二胺四乙酸(EDTA)抗凝，按照血液基因组DNA提取试剂盒说明书操作，提取标本基因组DNA。测定DNA浓度，加入双蒸水进行稀释，调整DNA浓度为50 μg/L，纯度要求为A260/A280为1.7～1.9。

1.6 实时荧光定量PCR法 在避光的环境下以SNP 0.15 μl，Master mix 3 μl，DNA 1 μl，双蒸水1.85 μl为一个反应体系配置成110个反应体系的母液，使用10 μl加样枪以6 μl为一个反应体系依次加入96孔板中，使用封板膜封板后在低速平板离心机以2 879×g离心1 min，启动实时荧光定量PCR仪操作软件，将离心后的96孔板放置于仪器中，调节扩增反应条件：50 ℃预变性2 min，95 ℃变性10 min，40个循环(95 ℃ 15 s，60 ℃ 1 min)，扩增结束后操作Analysis软件进行自动分型。

1.7 诊断标准 根据2007年中国成人血脂异常防治指南，分别将TC、TG、LDL-C边缘性升高者、升高者及HDL-C降低者归为异常血脂者，具体标准如下：TC≥5.18 mmol/L为高TC血症；TG≥1.70 mmol/L为高TG血症；LDL-C≥3.37 mmol/L为高LDL-C血症；HDL-C<1.04 mmol/L为低HDL-C血症。

2 结果

2.1 基础资料比较 三民族性别、年龄、Glu比较，差异均无统计学意义(P>0.05)；三民族BMI、TC、TG、HDL-C、LDL-C、吸烟率及饮酒率比较，差异有统计学意义(P<0.05，见表1)。三民族在TC、TG、HDL-C、LDL-C上的差异符合新疆流行病学调查结果[10]。

2.2 NFKB1基因启动子区-94ins/del ATTG基因型与等位基因频率比较 汉族、维吾尔族、哈萨克族NFKB1基因启动子区-94ins/del ATTG基因型分布经Hardy-Weinberg平衡检验，均符合Hardy-Weinberg平衡(χ2=1.035，P=0.309；χ2=1.072，P=0.300；χ2=3.630，P=0.057)，研究人群适合进行群体遗传学研究。三民族基因型分布比较，差异有统计学意义(P<0.05)。哈萨克族del/del基因型频率均低于汉族和维吾尔族，差异有统计学意义(χ2=11.986,P<0.01)。三民族del等位基因频率比较，差异有统计学意义(P<0.05，见表2)。

2.3 血脂异常组与血脂正常组基因型频率比较 比较汉族、维吾尔族和哈萨克族血脂异常组中del等位基因携带者(ins/del型+del/del型，ID+DD型)与血脂正常组中ID+DD型者分布频率，结果显示，三民族高TG血症组和TG正常组、高TC血症组和TC正常组、低HDL-C血症组和HDL-C正常组ID+DD型频率比较，差异均无统计学意义(P>0.05)；汉族高LDL-C血症组ID+DD型频率高于LDL-C正常组，差异有统计学意义(P<0.05，见表3～6，因本研究开展范围较大，血清样本丢失或失效，以实际表格数据为准)。

2.4 多因素Logistic回归分析 将汉族人群是否患有高LDL-C血症作为因变量，将性别、年龄、BMI、TG、HDL-C、吸烟、携带del等位基因作为自变量，结果显示，携带del等位基因、年龄、TG、HDL-C为影响汉族人群患有高LDL-C血症的因素(P<0.05，见表7)。

表1 三民族基础资料比较Table 1 Comparison of general data among the three peoples

注：*为χ2值;BMI=体质指数，Glu=葡萄糖，TC=总胆固醇，TG=三酰甘油，HDL-C=高密度脂蛋白胆固醇，LDL-C=低密度脂蛋白胆固醇

表2 三民族不同基因型及等位基因频率比较〔n(%)〕Table 2 Comparison of genotype and allele frequencies among the three peoples

注：与哈萨克族比较，*P<0.01

表5 不同民族高LDL-C血症组和LDL-C正常组ID+DD型频率比较Table 5 Comparison of frequency of ID+DD genotype between different peoples with high LDL-C and normal LDL-C

表6 不同民族低HDL-C血症组和HDL-C正常组ID+DD型频率比较Table 6 Comparison of frequency of ID+DD genotype between different peoples with low HDL-C and normal HDL-C

表7 影响汉族人群患有高LDL-C血症的多因素Logistic回归分析Table 7 Multivariate Logistic regression analysis on factors influencing high level LDL-C in Han peoples

3 讨论

NFKB1基因位于人类4号染色体2区4带，长156 kb，包括启动子序列、24个外显子和其间的内含子，编码NFKB/Rel和IκB家族中的2种蛋白：一种是不与DNA结合的p105(p50前体)，另一种是与DNA结合的p50[11]。Karban等[12]对NFKB1基因启动子区、编码外显子及内含子区域进行测序，结果显示，在6个检测出核苷酸变异位点中，只有启动子区-94ins/del ATTG具有潜在功能，del等位基因可以降低NFKB1基因的转录活性，减少p50的产生，p50自身可以形成同源二聚体，其不能被IκB有效结合并缺乏转录活性区域，进入细胞核后与p65/p50异源二聚体竞争核蛋白κB序列，从而抑制p65/p50活性。del等位基因的存在使p50蛋白生成减少，p50/p50同源二聚体相应减少，从而增强p65/p50活性。NF-κB活性增强，可促进其下游参与炎性反应的相关基因，如TNF-α、IL-1、IL-2、IL-6、IL-8、粒细胞集落刺激因子(G-CSF)、粒细胞-巨噬细胞集落刺激因子(GM-CSF)、细胞间黏附分子1(ICAM-1)、血管细胞黏附分子1(VCAM-1)等表达增加[13]。

本研究报道NFKB1基因启动子区域-94ins/del ATTG的基因型及等位基因在新疆汉族、维吾尔族、哈萨克族间的分布频率，结果显示，哈萨克族del/del基因型及del等位基因频率均低于汉族和维吾尔族，本试验人群来自新疆维吾尔族自治7个地区的26个乡镇所，通过随机抽样方法选取，具有一定的人群代表性。del等位基因可以使p50/p50二聚体产生减少，从而增强p50/p65活性，增加下游的炎性因子，使冠心病发病增加。新疆疾病流行病学调查表明，新疆哈萨克族高血压[14]、肥胖[15]、吸烟率等冠心病危险因素为汉族、维吾尔族、哈萨克族中最高的，但冠心病发病率却为三民族中最低[9]，这种情况单纯由饮食、环境因素不足以解释，可能需从不同民族的不同遗传背景入手，考虑哈萨克族与其他两个民族相比，在del等位基因分布上的差别，可能是其冠心病发病率较低的保护因素，有待行进一步研究证实。

由NF-κB调节的许多细胞因子，如TNF-α、IL-6、IL-1等均对血脂代谢有影响[16]，但目前有关二者相关性的研究较少，Real等[17]对高胆固醇家族中冠心病与NF-κB的相关性研究显示，家族性高胆固醇血症患者中血浆LDL-C水平显著升高，同时NF-κB活性和载脂蛋白B水平升高，提示患者体内的血脂代谢可能与NF-κB的活性相关。本研究对各异常血脂组中的基因型分布进行了分析比较，结果显示，汉族高LDL-C血症组del等位基因频率高于LDL-C正常组，Logistic回归分析结果显示，携带del等位基因是影响汉族人群患有高LDL-C血症的因素。但维吾尔族及哈萨克族del等位基因与高LDL-C血症的关系，考虑与以下几方面有关：(1)新疆维吾尔族及哈萨克族与汉族饮食及生活方式存在很大差异，维吾尔族和哈萨克族主要是以牛羊肉、奶制品和面食为主，蔬菜水果的摄入量较少，呈现高脂肪、高蛋白、高盐的膳食特点，故相较于汉族人群而言，饮食环境的影响可能削弱遗传因素对血脂水平的影响[18]。(2)NFKB1基因启动序列-94位点在不同民族间对同一种疾病的易患性不同，这也许是del等位基因只与新疆汉族人群患高LDL-C血症相关，而与新疆维吾尔族及哈萨克族间无关的原因。为进一步明确两者间是否相关，可进一步加大样本量，并同时测定不同患者及不同基因型间的NF-κB水平。

人类基因多态性的研究可以了解各种基因的基因型及等位基因在不同种族人群中的分布情况，有助于从基因水平更深刻地认识各种疾病在不同民族及人群中的发病率和临床表现各异的内在机制。本研究报道NFKB1基因启动子区-94ins/del ATTG的基因型及等位基因在新疆汉族、维吾尔族、哈萨克族间的分布频率，发现哈萨克族del/del基因型及del等位基因频率均低于汉族和维吾尔族；并且发现NFKB1基因启动子区-94ins/del ATTG多态性与汉族人群发生高LDL-C血症相关，为NFKB1基因启动子区-94ins/del ATTG的群体遗传学的研究和疾病相关性研究奠定基础。但本研究对NFKB1基因启动子区-94ins/del ATTG多态性与血脂关系的研究属于横断面研究，对两者之间的关系可以起到一定的提示作用，但两者间具体联系需进一步行病例对照试验进行分析。

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