丹红注射液对大鼠局灶脑缺血模型外周血内皮祖 细胞及神经功能缺损的影响

刘 冉,邸 丽,李 江,郝洪军,高 枫,孙 葳,黄一宁△

(1.北京大学第一医院神经内科，北京 100034；2.北京宣武医院神经内科,北京 100053)

丹红注射液是一种用于治疗脑梗死的中成药复方制剂，已有临床试验证实其可改善脑梗死后神经功能缺损程度[1,2]，但其作用机制尚未完全阐明。内皮祖细胞(Endothelial progenitor cells, EPCs)是一种具有增殖分化潜能的血管内皮前体细胞，正常情况下多储存于骨髓内，而脑缺血等应激状态下可动员至外周循环参与缺血组织的修复与再生[3，4]。增加脑缺血后EPCs数目或增强其修复能力，有可能作为新的作用靶点成为脑梗死治疗的研究方向之一。本研究拟通过大鼠脑梗死模型观察丹红注射液对脑梗死后EPCs数量及对神经功能缺损的影响，研究丹红注射液的作用机制。

1 材料与方法

1．1 动物与分组

清洁级雄性SD大鼠，体质量(280±20) g，由北京维通利华实验动物技术有限公司提供。实验动物按随机数字表法分为假手术组、对照组和丹红治疗组，每组各20只。

1.2 实验方法

术前1 h经尾静脉抽血后，对照组及丹红治疗组采用线栓法制作大脑中动脉梗死模型。术后6 h治疗组按照2ml/kg给予丹红浓缩注射液腹腔注射，对照组给予2 ml/kg生理盐水腹腔注射，间隔24 h 1次，连续5 d。在手术后24 h±2 h、72 h±2 h、168 h±2 h经尾静脉采血，用流式细胞术计数CD133+/VEGFR-2+双阳性细胞的百分率，并进行神经功能缺损评分。

1.3 线栓法制作永久性大脑中动脉栓塞(permanent Middle cerebral artery occlusion，p-MCAO)模型5

颈部正中切口，游离左侧肩胛舌骨肌结扎并剪断。仔细分离迷走神经，充分游离左侧颈总动脉、颈总动脉分叉处和颈外动脉起始端。结扎颈外动脉起始端和颈总动脉近心端，动脉夹暂时夹闭总动脉分叉处，并在动脉夹近心端打一松结备用，在颈总动脉结扎线远心端剪一小口将线栓送入，并将线结适当打紧以防出血。松开动脉夹，送线至距颈总动脉分叉处(18±0.5) mm， 稍感阻力时停止，最后将线结打紧固定线栓位置。用青霉素冲洗创口并逐层缝合，待动物清醒后放回笼中，自由摄食水。术中保持呼吸道通畅，使用60 W白炽灯高度为37 cm直接照射，保持肛温37℃。假手术组仅暴露颈部血管，不进行动脉结扎及放置线栓，其余步骤同对照组。

1.4 神经功能缺损评分

大鼠术后2 h及24 h±2 h、72 h±2 h、168 h±2 h由另一实验者在不告知分组的情况下进行神经功能评分。大鼠MCAO后神经功能评分标准(参照 Zea Longa 法6)：0：没有明显神经功能保障体征；1：对侧前肢不能完全伸展(轻度局灶神经功能障碍)；2：向对侧转圈(中度局灶神经功能障碍)；3：向对侧倾倒(重度局灶神经功能障碍)；4：不能自行活动，意识障碍。

1.5 流式细胞仪检测内皮祖细胞计数

静脉血100 μL加入兔抗人CD133单克隆IgG抗体(Abcam公司，ab16518)和小鼠抗人VEGFR-2单克隆抗体(Sigma公司，B0555)，采用美国BECKMAN COULTER公司EPICS-XL流式细胞仪，以Cell Quest软件进行流式细胞分析。在前向角散射光和侧向角散射光双参数点图上对单个核细胞群设窗，收集细胞500000个，以此群统计CD133+/VEGFR-2+细胞的百分率。所有操作人员均经过培训合格后方可上岗。

1.6 统计学方法

采用SPSS 16.0软件进行统计分析，等级资料及计量资料均采用中位数(最小值，最大值)进行描述，2组计量指标比较采用2个独立样本的秩和检验，所有检验均为双侧检验，P< 0.05为差异有统计学意义。

2 结果

2.1 各组大鼠神经功能缺损评分

对照组及丹红治疗组造模大鼠在完全清醒后均出现左侧Horner 征和右侧前肢为主的偏瘫，表现为右侧前肢屈曲、向右侧转圈，无动物出现意识障碍。

表1显示，丹红治疗组大鼠脑梗死后2 h神经功能缺损评分2(1、2)；梗死后24 h神经功能缺损评分2(1、4)；梗死后72 h神经功能缺损评分1(0、4)；梗死后168 h神经功能缺损评分0(0、1)。丹红治疗组梗死后24～48 h死亡2只，梗死后第96～120 h、第120～144小时、第144～168小时各死亡1只。

对照组大鼠脑梗死后2 h神经功能缺损评分2(1、2)，梗死后24 h神经功能缺损评分2.5(0、4)，梗死后72 h神经功能缺损评分2(0、4)，梗死后168 h神经功能缺损评分3(0、4)。对照组梗死后24～48 h死亡5只，48～72 h死亡4只，术后第72～96小时及第96～120小时各死亡2只。假手术组大鼠各时间点神经功能缺损评分均为0。

表1 丹红治疗组及对照组大鼠神经功能缺损评分

2.2 丹红治疗组、对照组及假手术组各时间点外周血CD133+/VEGFR-2+双阳性细胞数百分率

表2显示，丹红治疗组、对照组及假手术组MCAO术前、术后24 h、术后72 h和术后168 h内皮祖细胞百分率，3组术前EPCs数量百分率比较差异无统计学意义。

与对照组比较，丹红治疗组大鼠脑梗死后24 h、72 h及168 h EPC数量百分率显著升高(P<0.01,P<0.01,P<0.01)。与假手术组比较，丹红治疗组术后24 h、72 h外周血EPCs数量显著升高(P<0.01，P<0.01)，2组术后168 h比较差异无统计学意义(P=0.610)。

假手术组与对照组术后24 h和术后72 h2组外周血EPC数量比较差异无统计学意义(P=0.839，P=0.804)；术后168 h对照组外周血EPC数量比假手术组显著降低(P=0.001)。

3 讨论

EPCs是一种位于骨髓内具有增殖分化潜能的内皮前体细胞，脑缺血所致的血管内皮功能受损以及炎性细胞和一些集落刺激因子可诱导EPCs动员进入外周血并归巢到损伤部位，通过促进血管新生，改善局部适宜神经再生的微环境，分泌某些细胞因子如脑源性营养因子(brain-derived neurotrophic factor BDNF)刺激神经干细胞再生，并提高神经元的功能[8～13]等机制参与损伤组织的修复重建，改善神经系统功能[12,14]。Moubarik等报道，脑梗死后经静脉注射移植的EPCs可迁移到缺血区域，促进神经功能缺损的恢复[15,16]。但目前EPCs移植受分离培养、手术条件及伦理学限制较大，距临床应用仍有一定距离。国内已有相关研究发现，EPCs能够改善外周缺血组织的供血[17,18]，但专门针对缺血性脑卒中的研究尚少[19,20]。以上研究结果提示，EPC能够改善脑梗死后神经功能缺损，如能利用药物干预的方法诱导其EPCs动员的生理性高峰前移，或者促进其向损伤部位迁移，就有可能在一定程度上达到类似外源性补充EPCs的效果，更有效地修复损伤组织，改善神经元功能及预后，这种方法在临床上简便易行，也更易为患者接受。因此，本研究试图观察丹红注射液对脑梗死后EPCs数量及功能的影响，如取得肯定效果，将对脑缺血的治疗理念产生重大影响。内皮祖细胞的判定方法目前仍无统一标准，通过流式细胞仪根据细胞表面标志抗原直接从外周血中进行细胞检测，因其敏感、精确、可重复性好，是目前普遍采用的方法[21]。本研究采用流式细胞术，选用CD133+ / VEGFR-2+ 双阳性作为判定内皮祖细胞的标准。其中CD133是个跨膜蛋白，在人骨髓、胎肝和外周血的造血干细胞上均有表达，也表达于EPCs，且不表达于成熟内皮细胞。KDR/VEGFR-2也是前体细胞的早期标志。

表2 丹红治疗组、对照组和假手术组各时间点CD133+/VEGFR-2+双阳性细胞数百分率 (%)

本研究显示，对照组外周血EPCs高峰在72 h内均不明显，7 d时甚至有所下降，提示生理状态下脑梗死后EPCs动员水平较低，远不足以完成神经系统修复，因此可能导致不可逆的神经细胞损伤，甚至出现神经功能缺损症状，这同时也解释了对照组大鼠在梗死早期死亡率高于丹红治疗组的原因。而丹红治疗组大鼠脑梗死后不仅存活率显著升高，外周血EPCs数量亦显著高于对照组；即使术后7 d丹红治疗组EPCs数量均有所下降，但仍显著高于对照组。上述结果说明，丹红注射液无论在脑缺血早期还是晚期均能显著增加外周血EPCs数量，但这种促进作用有随时间延长而减弱的趋势，提示其作用主要局限于早期，对晚期再生修复功能改善有限。比较神经功能评分发现，丹红治疗组评分从术后24 h开始即低于对照组，且一直持续到术后168 h，但由于样本量较小，差异无统计学意义，还需进一步研究以验证丹红注射液对脑梗死大鼠神经系统功能的作用。

丹红注射液由丹参、红花2味药组成，丹参和红花为中医经典活血化瘀植物药，二药合用起到活血化瘀、通脉舒络的作用。现代药理研究表明，丹红注射液包含丹参酮、丹参酚酸、红花黄色素等主要成分，上述成分综合作用可有效预防或减轻脑缺血再灌注损伤。已有研究发现，丹红改善循环的机制可能为内皮祖细胞在脑缺血后的修复作用再生提供适合的血管微环境，从而改善神经功能。也有研究发现，VEGF具有能够增加脑梗死后内皮祖细胞数量和改善神经功能的作用，丹红是通过这条通路间接增加内皮祖细胞数量，或是通过其他机制正在研究中。

本研究的局限性是只观察了丹红注射液增加外周血EPCs数目的作用，未能明确其对EPCs归巢、分化等功能状态的影响，无法证实EPCs数目增加与改善神经功能缺损的因果关系，无法从功能上证实其作用，还需进一步的实验结果来阐明。

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