戊四氮诱导大鼠癫痫模型中前脑磷酸化DARPP-32与嗜酸损伤神经元的相关性研究

王伟文，廖晓阳，杨正辉，林 航，王庆松，吴俞宪，刘 榆

Dazzi等[1]研究报道，在重复系统给予亚惊厥剂量戊四氮(PTZ)诱发的癫痫模型中，位于前脑皮质、伏隔核及纹状体等区域的细胞外多巴胺神经递质水平明显升高，并且这种内源性多巴胺神经递质的升高与中枢神经元的兴奋毒性有关[2]。DARPP-32(dopamine and adenosine 3′5′-monophosphate-regulated phospho-protein,Mr 32 kD)是多巴胺下游作用的一个重要分子靶点，主要分布于含有D1受体的神经元上，磷酸化DARPP-32(p-DARPP-32)在多巴胺调解包括N-甲基-D-天冬氨酸(NMDA)、γ-氨基丁酸(GABA)等各类兴奋或抑制性神经递质生物学效应方面扮演着中心角色[3-4]。那么，p-DARPP-32在PTZ诱发的癫痫模型中是否介入了癫痫所致的神经元损伤是本研究所探讨的问题。本实验应用免疫酶组织化学及苏木素-伊红染色法研究PTZ诱导的全面性癫痫大发作后DARPP-32在大鼠前脑的磷酸化表达分布情况及其时程变化与嗜酸损伤神经元时程变化之间的可能联系，以探讨p-DARPP-32在实验性大鼠癫痫模型中存在的神经元损伤所扮演的角色。

1 材料与方法

1.1 实验动物 健康成年雄性SD(Sprague-Dawley)大鼠35只, 体质量210～230 g(第四军医大学实验动物中心提供),置于温暖(20 ℃)、安静环境中饲养48 h。

1.2 实验分组与模型制备

1.2.1 实验分组 采用随机数字表法将大鼠分为5个实验组(n=5)和1个对照组(n=10):(1) A组：PTZ 1 h,大鼠在PTZ诱发癫痫发作1 h后被处死，后几组按相应的时间处死；(2) B组：PTZ 6 h；(3) C组：PTZ 24 h；(4)D组：PTZ 48 h；(5)E组：PTZ 72 h；(6)对照组大鼠接受同样体积和次数的0.9%氯化钠溶液腹腔注射，而后在与上述各组相应的时间点被处死，每个时间点2只大鼠。

本文创新点

尽管实验动物癫痫模型中将嗜酸神经元作为观察脑神经元凋亡、坏死指标的文献报道很多，但在重复系统给予亚惊厥剂量的戊四氮(PTZ)诱导癫痫持续状态模型中有关嗜酸神经元数量在前脑时程变化的文献报道较少。DARPP-32是多巴胺下游作用的一个重要分子靶点，磷酸化DARPP-32(p-DARPP-32)在多巴胺调解包括N-甲基-D-天冬氨酸(NMDA)、γ-氨基丁酸(GABA)等各类兴奋或抑制性神经递质生物学效应方面扮演着核心角色。而有关DARPP-32在癫痫动物模型中前脑的磷酸化表达更是少有报道，本研究即通过对PTZ诱导的癫痫持续状态模型中p-DARPP-32在大鼠前脑的表达分布及时程变化状况来推测DARPP-32可能参与了癫痫模型病理生理的调控。通过对该癫痫模型中p-DARPP-32时程变化与嗜酸损伤神经元时程变化之间存在的同步正相关分析以间接证明p-DARPP-32在该模型所致的神经元损伤中发挥着作用。

1.2.2 模型制备 各实验组大鼠均接受重复低剂量PTZ腹腔注射以最终达到全身性癫痫持续状态(SE)。重复PTZ腹腔注射方案：首剂给予20 mg/kg PTZ，然后每间隔10 min腹腔注射10 mg/kg PTZ直至SE发作。SE发作的特征是：大鼠出现连续的跌倒强直发作期(10～15 s)，而后反复出现几分钟的头和肢体的阵挛性发作[5]。大鼠在SE发作后被放回温暖(20 ℃)、安静环境中饲养，分别在相应的时间被处死[6]。

1.3 切片制备 大鼠经1%戊巴比妥钠(40 mg/kg)腹腔注射深度系统麻醉后，予以左心室至升主动脉插管，含40 g/L多聚甲醛的0.1 mol/L磷酸缓冲液(PBS，pH 7.4)灌流固定，冷冻切片机上行全脑组织连续冠状切片，30 μm厚的组织切片被收集用于以后的免疫组织化学染色分析。

1.4 免疫组织化学染色 各实验组全脑系列切片行免疫组织化学染色(ABC法)，首先一抗(兔抗p-DARPP-32, Cell Signaling, 1∶150) 4 ℃孵育48 h；其次二抗(驴抗兔生物素标记的IgG，Check, 1∶400)室温孵育4 h；最后ABC复合物(Vector, 1∶400)室温下孵育2 h，二氨基联苯胺(DAB)棕色显色，切片经晾干、脱水、透明后封片。在Olympus BX-60显微镜下分析观察结果，并采集图像。对照实验中用正常兔血清替代一抗，余染色步骤同前。半定量分析位于大鼠皮质、海马和纹状体区域SE发作后不同时段的p-DARPP-32阳性神经元数量，每只大鼠每个区域挑选6～8张切片(双侧)用以计数。

1.5 苏木素-伊红染色 各实验组经全脑系列切片后进行常规苏木素-伊红染色，显示嗜酸损伤神经元在大鼠皮质、海马及纹状体区域的分布数量。

2 结果

2.1 不同组大鼠皮质、海马和纹状体p-DARPP-32阳性神经元数量比较 不同组大鼠皮质、海马和纹状体p-DARPP-32阳性神经元数量比较，差异均有统计学意义(P<0.05)；其中与对照组比较，A组、B组、C组、D组、E组大鼠皮质、海马和纹状体p-DARPP-32阳性神经元数量均升高，差异有统计学意义(P<0.05)；A组与B组比较，差异均无统计学意义(P>0.05)；C组较A组和B组均降低，差异有统计学意义(P<0.05)；D组和E组较C组均降低，差异有统计学意义(P<0.05)；D组与E组比较，差异均无统计学意义(P>0.05，见表1)。

2.2 p-DARPP-32阳性神经元在大鼠前脑的表达分布 PTZ诱发SE发作1 h后，p-DARPP-32阳性神经元在大鼠前脑存在着广泛的分布。在皮质，p-DARPP-32阳性神经元主要分布于Ⅱ、Ⅲ和Ⅴ层，主要表达在胞质、胞核上；在海马，p-DARPP-32阳性神经元在CA2、CA3区呈密集分布，而在CA1、CA4及齿状回亚区也有散在的表达，且p-DARPP-32主要表达在胞质及胞核上；在纹状体，p-DARPP-32阳性神经元主要分布在中间棘神经元的胞质和胞核中(见图1)。

2.3 不同组大鼠皮质、海马和纹状体嗜酸损伤神经元数量比较 不同组大鼠皮质、海马和纹状体嗜酸损伤神经元数量比较，差异均有统计学意义(P<0.05)；其中与对照组比较，A组、B组、C组、D组、E组大鼠皮质、海马和纹状体嗜酸损伤神经元数量均升高，差异有统计学意义(P<0.05)；B组较A组升高，差异均有统计学意义(P<0.05)；C组较B组均升高，差异有统计学意义(P<0.05)；C组、D组、E组比较，差异均无统计学意义(P>0.05，见表2)。

Table1 Comparison of the number of p-DARPP-32 positive neurons in cortex, hippocampus and corpus striatum of different groups

组别只数皮质海马纹状体对照组10194±54350±91430±134A组5420±106∗1074±345∗890±296∗B组5397±113∗1030±373∗880±314∗C组5330±74∗△▲792±243∗△▲673±217∗△▲D组5277±77∗☆670±191∗☆500±157∗☆E组5260±58∗☆654±172∗☆492±147∗☆F值10093311477178952P值<0001<0001<0001

注：与对照组比较，*P<0.05；与A组比较，△P<0.05；与B组比较，▲P<0.05；与C组比较，☆P<0.05

注：a(免疫组织化学，×40)、a′(免疫组织化学，×400)皮质，b(免疫组织化学，×40)、b′(免疫组织化学，×400)海马, c(免疫组织化学，×40)、c′(免疫组织化学，×400)纹状体

图1 PTZ诱导SE发作1 h后，p-DARPP-32阳性神经元在皮质、海马及纹状体区域的分布

Figure1 Distribution of p-DARPP-32 positive neurons in cortex, hippocampus and corpus striatum one hour after the onset of SE induced by PTZ

Table2 Comparison of the number of acidophilic neurons in cortex, hippocampus and corpus striatum of different groups

组别只数皮质海马纹状体对照组10060±041020±004134±037A组5280±138∗048±009∗580±201∗B组5461±200∗△178±048∗△1344±483∗△C组5870±283∗▲389±087∗▲1780±681∗▲D组51074±431∗397±084∗2000±502∗E组5922±378∗401±113∗1970±511∗F值203628648593298800P值<0001<0001<0001

注：与对照组比较，*P<0.05；与A组比较，△P<0.05；与B组比较，▲P<0.05

2.4 光镜下损伤神经元的病理特征 PTZ诱导SE发作后，嗜酸损伤神经元在包括皮质、海马及纹状体在内的前脑区域均可观察到。嗜酸损伤神经元均显示出细胞核固缩及胞体形状不规则，胞质、胞核呈伊红着色，部分区域尚有炎性细胞浸润(见图2)。

3 讨论

本研究结果显示，PTZ诱导SE发作后p-DARPP-32在大鼠前脑皮质、海马及纹状体均存在着明显表达，且主要表达在神经元的胞质、胞核上，其总体分布与DARPP-32在前脑的分布相重叠[7]。且p-DARPP-32的表达存在着一个时程变化，即发作1 h、6 h后p-DARPP-32在前脑神经元的表达达到了高峰，24 h后开始逐渐下降。同样，嗜酸损伤神经元数量也存在着时程变化，即SE发作后嗜酸损伤神经元数量在相同时点开始逐渐升高，其上升趋势在发作24 h后才逐渐停止。SE发作24 h内p-DARPP-32与嗜酸损伤神经元数量同步增长；24 h后p-DARPP-32表达的水平下降时，嗜酸神经元数目的增加也趋于平缓。

癫痫是一种因大脑半球局部神经元电活动过度活跃所致的以临床发作为特征的病理状况。而癫痫持续状态则常导致广泛性的脑神经元损伤。具体的损伤机制尚不清楚，部分原因可能与神经元细胞内的钙超载，最终导致细胞毒性损伤有关[8]。Fujikawa[9]应用苏木素-伊红染色法来评价癫痫所致的急性神经元损伤，认为阳性嗜酸损伤神经元在光镜水平上可作为评价不可逆损伤神经元的标准。并且，光镜水平下脑的嗜酸细胞已经被证明与电镜下的细胞坏死密切关联[10]。文献中所描述的嗜酸损伤神经元在光镜下显示为细胞核的固缩及胞核、胞质伊红着色，本实验中所观察到的嗜酸损伤神经元特征基本与之一致。SE发作1 h后，嗜酸神经元数量在大鼠前脑开始逐渐升高，直至发作24 h后其上升趋势才逐渐停止。癫痫发作后脑神经元出现凋亡、坏死在以往的文献中多有报道[8]，但缺乏嗜酸损伤神经元发生、发展变化时程的报告，尤其在PTZ诱导的SE模型中。

注：a对照组皮质，a′ C组皮质、b对照组海马，b′ C组海马，c对照组纹状体，c′ C组纹状体

图2 PTZ诱导SE发作后嗜酸损伤神经元在大鼠前脑区域的镜下特征(苏木素-伊红染色，×400)

Figure2 Pathological features of acidophilic neurons in rat forebrain by light microscopy

以往PTZ诱导的癫痫模型中已有报道，位于前脑皮质、纹状体等区域的细胞外多巴胺神经递质水平明显升高，且多巴胺水平的增加与所给PTZ剂量呈正性线性相关[1，7]。而DARPP-32是多巴胺下游作用的一个重要分子靶点，该模型中多巴胺神经递质可能通过激活D1/DARPP-32/PPI信息链导致DARPP-32磷酸化[11]。这从理论上解释PTZ诱导的癫痫模型中DARPP-32存在着磷酸化变化。

另外，有趣的是嗜酸损伤神经元数量逐渐增高的这一时程变化与p-DARPP-32表达的时程变化有一定的相关性。SE发作后24 h内呈正相关，24 h后p-DARPP-32表达的水平开始下降，可能是DARPP-32的磷酸化表达已经达到顶峰，并开始衰减。而嗜酸损伤神经元数目的增加趋于平缓可能与p-DARPP-32的衰减有关，而本身存在的嗜酸损伤神经元数目在一段时间内不会减少或消失。Dazzi等[1]研究报道，在重复系统给予亚惊厥剂量PTZ诱发的癫痫模型中，位于前脑皮质、伏隔核及纹状体等区域的细胞外多巴胺神经递质水平明显升高，并且这种内源性多巴胺神经递质的升高与中枢神经元的兴奋毒性有关[2]。DARPP-32是多巴胺下游作用的一个重要分子靶点，主要分布于含有D1受体的神经元上，p-DARPP-32在多巴胺调解包括NMDA、GABA等各类兴奋或抑制性神经递质生物学效应方面扮演着中心角色[3-4]。SE发作后细胞外多巴胺递质水平的升高可能最终通过激活多巴胺/D1/DARPP-32/PP-1信息链而使大鼠前脑神经元上的DARPP-32磷酸化，继而通过调节NMDA受体、α-氨基-3-羟基-5-甲基-4-异恶唑丙酸受体(AMPA受体)及左型Ca2+通道磷酸化的活性或提高这些离子通道介导的Ca2+内流，使细胞内Ca2+水平升高，而异常的Ca2+内流在神经元兴奋毒方面起着重要作用[11-13]。上述理论预示了SE发作后p-DARPP-32表达与嗜酸损伤神经元在大鼠前脑同步变化可能存在因果关系。因此，后期对模型中同步多巴胺水平的变化监测及p-DARPP-32和凋亡神经元的定量分析将进一步阐明本研究结果。

综上所述，在重复系统给予亚惊厥剂量PTZ诱发的癫痫模型中，本实验通过对p-DARPP-32在大鼠前脑的表达分布及其时程变化与嗜酸损伤神经元数量时程变化的关系研究结果提示，SE发作后p-DARPP-32与嗜酸损伤神经元数量的时程变化有着一定的同步相关性，即SE发作后同步上升，24 h后p-DARPP-32表达的水平下降，而嗜酸损伤神经元数量的增加也趋于平缓。癫痫发作后，多巴胺激活D1/PKA/DARPP-32/PP-1信息链可能是导致大鼠前脑神经元广泛性损伤的重要原因之一，而p-DARPP-32在多巴胺发挥生理作用方面扮演着重要角色。

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