强直性脊柱炎患者血清白介素9的表达及其意义

王倩倩，魏 平，孟景红

强直性脊柱炎(ankylosing spondylitis，AS)是一种慢性进行性炎症性脊柱关节病，其发病机制尚不明确，多种炎性细胞因子在疾病发展过程中发挥了重要的作用。Th9细胞主要分泌白介素9(interleukin-9，IL-9)[1-2]，该因子通过其受体IL-9R介导连接蛋白/信号转导子和转录激活子(JAK/STAT)信号通路，是参与免疫应答和免疫调节的重要细胞因子，在自身免疫疾病中的作用受到广泛关注。已有研究表明，Th9细胞及IL-9在类风湿性关节炎、系统性红斑狼疮、系统性硬化症等风湿性疾病中均表达异常[3-5]。本研究旨在测定AS患者血清中IL-9的表达水平，初步探讨其临床意义。

1 资料与方法

1.1 一般资料 选择2012年10月—2013年4月在河北医科大学第三医院免疫风湿科住院及门诊治疗的AS患者40例为AS组，诊断标准符合2010年国际脊柱关节病评价工作组(ASAS)脊柱关节炎新分类标准，其中男33例，女7例；年龄19～56岁，平均(31±9)岁；病程1个月～40年，平均(8.2±8.0)年。记录患者的病程、C反应蛋白(CRP)、红细胞沉降率(ESR)、Bath强直性脊柱炎活动性指数(BASDAI)等临床指标。排除标准：合并其他结缔组织病；妊娠或哺乳期妇女；合并心血管、肝、肾和造血系统等严重疾病；以前接受肿瘤坏死因子α(TNF-α)药物治疗；精神病患者；正处于急慢性感染期间；恶性肿瘤患者。将患者根据BASDAI分为(BASDAI≤4)稳定组12例、(BASDAI>4)活动组28例。另选择同时期门诊体检的健康者24例为对照组，其中男18例，女6例；年龄23～41岁，平均(28±4)岁。两组年龄及性别具有均衡性。

1.2 主要试剂和仪器 人IL-9酶联免疫吸附试验(ELISA)试剂盒购于RD生物科学公司。主要仪器：全自动定量酶标仪(芬兰Labsystems Multiskan MS 352型)、台式离心机(北京离心机厂LDZ5-2)、电热恒温水温箱(成都赛可隆机械设备有限公司HH-501)、加样器枪头、加样器、计时器、纸巾、蒸馏水等。

1.3 方法

1.3.1 标本收集 AS组、对照组均于夜间禁食8 h以上，于清晨空腹坐位时经肘静脉采血约3 ml，室温静置20 min后离心分离血清,3 000 r/min,20 min(离心半径135 mm)，收集上清液，放置于-20 ℃冰箱内冻存待测。

1.3.2 ELISA法检测血清IL-9水平 取上述冻存待测样本放置于室温下复融，通过ELISA双抗体夹心法检测IL-9水平。具体操作步骤严格按照ELISA说明书操作。

2 结果

2.1 血清IL-9水平比较 稳定组和活动组患者血清IL-9水平高于对照组，活动组患者血清IL-9水平高于稳定组，差异均有统计学意义(P<0.05，见表1)。

2.2 AS患者血清IL-9水平与临床指标的相关性 AS患者IL-9水平与CRP(r=0.529，P=0.000)、ESR(r=0.339，P=0.033)、BASDAI(r=0.623，P=0.000)均呈正相关，与病程无相关性(r=0.233,P=0.148)。

表1 各组血清IL-9水平比较

注：IL-9=白介素9；与对照组比较，*P<0.05；与稳定组比较，△P<0.05

3 讨论

目前国内外关于IL-9的研究主要集中在过敏性疾病、系统性硬化症等自身免疫疾病，与AS的临床相关性研究报道较少。最初研究认为，IL-9是Th2类细胞因子，但其调节作用和生物活性不同于白介素4(IL-4)、白介素5(IL-5)、白介素13(IL-13)等Th2细胞因子。其受体IL-9R，主要分布在肥大细胞、T或B淋巴细胞、巨噬细胞、中性粒细胞、嗜酸粒细胞及支气管上皮细胞等，因此IL-9在免疫系统里是一个多效的细胞因子，如感染时可与IL-13协同促进肥大细胞的募集和增殖，加重炎性反应[6]；诱导原始CD4+T细胞分化为Th17细胞[7]；与IL-4共同作用刺激B淋巴细胞分泌IgG和IgE型抗体等，在过敏性疾病(尤其是过敏性哮喘)中发挥着重要作用[8-9]。2008年12月，Veldhoen等[1]和Dardalhon等[2]两个研究小组同时报道，CD4+初始T细胞在IL-4和转化生长因子β(TGF-β)的共同刺激作用下分化为IL-9+白介素10(IL-10)+Foxp3-效应性T细胞，因此类细胞主要分泌IL-9，将其命名为Th9，之后研究证实，Th9细胞也可由TGF-β诱导分化的Th2细胞转化而来。Dardalhon等[2]研究小鼠肠炎模型发现，Th9细胞不具有抑制炎症功能，而是通过IL-9与各类效应性T细胞和细胞因子相互作用发挥调节免疫作用，使炎性细胞的数量上升并分泌一些炎性递质促进炎症反应。目前IL-9与自身免疫疾病的发病机制关系尚不明确，本研究通过检测AS患者外周血中IL-9的表达水平，初步探讨其在AS疾病进展中可能发挥的作用，并分析该细胞因子与疾病活动及临床指标的相关性。

本研究发现，AS患者血清IL-9水平明显高于对照组，且AS活动组IL-9水平高于稳定组，故推测IL-9水平的上调可能与AS的发病机制密切相关，并且能促进疾病炎症进展。Tan等[10]试验证实，过敏性哮喘患者体内IL-9的表达水平明显高于健康对照组，提出IL-9促进过敏炎症反应，与哮喘呼吸道炎症、气道高反应性等特征有关。Sato等[3]研究系统性红斑狼疮小鼠模型提出，在TGF-β存在的条件下，IL-9可以促进原始CD4+T细胞向Th17细胞分化，致Th17细胞显著升高，推测IL-9可能通过对Th17细胞的调节在系统性红斑狼疮的发病机制中发挥重要作用，之后Yanaba等[4]研究表明，系统性红斑狼疮患者外周血中IL-9的表达水平是增高的，但其与系统性红斑狼疮的免疫学机制尚待进一步研究。崔冉等[5]研究类风湿关节炎患者外周血中Th9细胞的表达率及IL-9的表达水平时发现，患者体内的含量明显高于健康对照组，且随着疾病的活动度增强而升高，推测Th9细胞的增多可能是类风湿关节炎发病的一个重要原因，并与疾病活动度一致，本研究得出的结果与之一致。

本研究结果还发现，IL-9水平与AS患者的BASDAI及CRP、ESR等炎性指标呈正相关，说明IL-9水平的上调可能导致病情活动，这也证实了IL-9具有促进炎症反应的功能。而IL-9水平与病程无明显相关性，表明该细胞因子参与了AS的整个疾病发展过程。Khan等[11]研究表明，类风湿关节炎患者在基线和不同时间点(3、6、9个月)接受利妥昔单抗治疗后，对其血清样本进行测定，结果显示利妥昔单抗可以显著下调IL-9的表达水平，减轻炎症，缓解疾病进展，这一结论可以解释IL-9不仅参与了疾病的炎症反应，而且贯穿疾病的始终，推测IL-9是调节自身免疫疾病炎症和高反应性的一种新的治疗靶向。

综上所述，AS患者外周血中IL-9水平明显高于对照组，提示IL-9是一个与AS免疫发病机制密切相关的致炎细胞因子，且该细胞因子在AS患者中的表达水平与疾病活动度及临床炎性指标呈正相关，表明IL-9在促进AS疾病炎症进展中发挥了重要作用。

1 Veldhoen M,Uyttenhove C,van Snick J,et al.Transforming growth factor-beta′reprograms′the differentiation of T helper 2 cells and promotes an interleukin-9-producing subset[J].Nat Immunol,2008,9(12): 1341-1346.

2 Dardalhon V,Awasthi A,Kwon H,et al.IL-4 inhibits TGF-β-induced Foxp3+ T cells and,together with TGF-β,generates IL-9+IL-10+Foxp3(-)effector T cells[J].Nat Immunol,2008,9(12): 1347-1355.

3 Sato K,Suematsu A,Okamoto K,et al.Th17 functions as an osteoclastogenic helper T cell subset that links T cell activation and bone destruction[J].J Exp Med,2006,203(12): 2673-2682.

4 Yanaba K,Yoshizaki A,Asano Y,et al.Serum interleukin 9 levels are increased in patients with systemic sclerosis: association with lower frequency and severity of pulmonary fibrosis[J].J Rheumatol,2011,38(10): 2193-2197.

5 崔冉,徐建华.类风湿关节炎患者外周血辅助性T细胞9及白细胞介素-9的变化及临床意义[J].中华风湿病学杂志,2012,16(7): 442-445.

6 Mesplès B,Fontaine RH,Lelièvre V,et al.Neuronal TGF-beta1 mediates IL-9/mast cell interaction and exacerbates excitotoxicity in newborn mice[J].Neurobiol Dis,2005,18(1): 193-205.

7 Angkasekwinai P,Chang SH,Thapa M,et al.Regulation of IL-9 expression by IL-25 signaling[J].Nat Immunol,2010,11(3): 250-256.

8 Durrant DM,Metzger DW.Emerging roles of T helper subsets in the pathogenesis of asthma[J].Immunol Invest,2010,39(4/5): 526-549.

9 Osterfeld H,Ahrens R,Strait R,et al.Differential roles for the IL-9/IL-9 receptor alpha-chain pathway in systemic and oral antigen- induced anaphylaxis[J].J Allergy Clin Immunol,2010,125(2): 469-476.

10 Tan C,Aziz MK,Lovaas JD,et al.Antigen-specific Th9 cells exhibit uniqueness in their kinetics of cytokine production and short retention at the inflammatory site[J].J Immunol,2010,185(11): 6795-6801.

11 Khan IH,Krishnan VV,Ziman M,et al.A comparison of multiplex suspension array large-panel kits for profiling cytokines and chemokines in rheumatoid arthritis patients[J].Cytometry B Clin Cytom,2009,76(3): 159-168.