南昌地区献血者HBV感染隐匿风险与基因型调查分析

钱榕，方昌志，熊丽红，杨莉娜

(江西省血液中心，江西南昌330077)

·实验研究·

南昌地区献血者HBV感染隐匿风险与基因型调查分析

钱榕，方昌志，熊丽红，杨莉娜

(江西省血液中心，江西南昌330077)

目的探讨南昌地区献血者乙型肝炎病毒(Hepatitis B Virus,HBV)感染隐匿风险与HBV感染人群中HBV基因分型，为血液筛查策略、地区流行病学提供研究数据。方法(1)对2012年1月1日至2012年12月31日64 400份献血者标本采用ELISA法进行HBsAg筛检；(2)对HBsAg筛检阴性标本进行HBV/HCV/HIV 3项联合病毒核酸检测(Nucleic Acid Amplification Testing,NAT)，再对NAT阳性标本进行HBV DNA定量及血清乙肝五项标志物检测；(3)选取HBsAg筛查阳性标本200份和HBsAg筛查阴性而HBV DNA阳性标本30份，对所有HBV DNA阳性标本进行病毒核酸提取、扩增及测序分型，检测HBV基因型。结果(1)64 400份献血者标本中共检出HBsAg阳性862份和阴性63538份；HBsAg检测阴性标本通过NAT检测，共检出HBV DNA阳性84份，献血者HBV感染率为1.47%，HBV输血感染隐匿风险为0.13%；(2)献血者HBV感染以隐匿型为主(75.0%，63/84)，其病毒载量多数＜20/ml(70.2%，59/84)；3)选取的200份HBsAg阳性标本中共检出HBV DNA阳性118份，148份HBV DNA阳性标本有66份样本分型成功，共检出B基因型为47份(71.2%)，C基因型为19份(28.8%)，未检出其它基因型。结论ELISA法筛查HBsAg阴性的献血者中HBV感染隐匿风险依然存在，且多以低病毒载量的隐匿性感染为主，应对献血者标本常规开展NAT检测；南昌地区献血者中HBV感染基因型以B型为主，C型次之，未见其它基因型。

献血者；HBsAg；基因型；核酸检测；风险

乙型肝炎病毒(Hepatitis B Virus,HBV)感染可致人体出现急性、慢性肝炎、肝硬化等疾病，能通过输血传播，属血液传播性疾病。我国对献血者HBV感染筛查主要通过ELISA法检测HBsAg，但由于病毒感染窗口期、隐匿性肝炎(Occult HBV Infection,OBI)、基因变异等因素的存在，少数HB-sAg筛查阴性的献血者体内仍有存在一定程度HBV DNA复制的可能，ELISA法筛查HBsAg存在一定的局限性，因此，需要通过病毒核酸检测技术(Nucleic Acid Amplification Testing,NAT)对献血者样本进行HBV DNA检测来降低HBV输血感染隐匿风险，提高输血安全性[1-5]。本研究通过对2012年南昌地区献血者标本的HBV感染检测，分析了本地区献血者HBV感染率及HBV输血感染的隐匿风险，并探讨了献血者HBV感染基因型分布情况，现报告如下。

1 材料与方法

1.1 标本来源与处理本中心2012年1月1日至2012年12月31日HBsAg试纸快筛合格的无偿献血者64 400名，献血后均留取血液标本3管：2管为带分离胶EDTA抗凝真空采血管，每管血样5 ml，其中1管用于NAT检测，另1管用于HBV分型检测；1管为EDTA抗凝真空采血管，血样5 mL，用于HBsAg检测；所有标本经3 000 g×15min离心后，HBV分型样本置-20℃冻存，其余标本均保存于2～8℃冰箱。

1.2 仪器与试剂Hamilton Microlab Star全自动加样仪(瑞士哈密顿公司)；XANTUS全自动加样仪(深圳爱康电子有限公司)；FAME全自动酶免分析仪(瑞士哈密顿公司)；Cobas s201(瑞士罗氏公司)；AB3500XI测序仪(美国ABI公司)；HBsAg金标快筛试剂(厦门新创)，HBsAg ELISA检测试剂(厦门新创和北京金豪)，核酸定性筛查试剂：Cobas TaqScreen MPX Test 1.0(瑞士罗氏诊断公司)；核酸定量检测试剂：COBASRAmpliPrep/COBASRTaq-Man HBV Test2.0(瑞士罗氏诊断公司)；DNA提取试剂：QIAamp DNA Mini Kit(QIAGEN公司)；所有试剂均在有效期内使用。

1.3 检测流程

1.3.1 HBsAg试纸快筛检测献血者在献血前采用金标快筛试剂进行HBsAg检测，对金标法HBsAg检测结果合格的献血者，按要求采集和保存血液标本。

1.3.2 HBsAg ELISA检测所有献血者标本同时选用两种不同厂家试剂采用ELISA法进行HBsAg检测，对HBsAg筛检阴性标本进行病毒核酸检测。判定规则：每板设置阴性与弱阳性质控各一孔，室内质控在控则判定本批次实验结果有效；酶免检测S/CO≥1判为有反应性，S/CO值在0.8～1之间设置为灰区；双试剂检测均为S/CO≥0.8判定为不合格，如仅单试剂检测S/CO≥0.8，采用同种试剂对该标本进行双孔复检，任1孔S/CO≥0.8判为不合格。

1.3.3 病毒核酸检测采用Cobas TaqScreen MPX 1.0试剂对阴性血液标本进行HBV/HCV/HIV 3项NAT检测，检测模式为混样检测+拆分检测，先将6份标本(167μl/份)汇集为1份混样标本(1ml)，在Cobas s201血液核酸筛查平台上进行检测，如混样检测结果为阴性，则该6份标本NAT检测阴性，如混样检测结果为阳性，则该6份标本进行单标本拆分检测(1ml/份)，如单标本检测结果为阴性，则该份标本3项NAT联合检测阴性，反之，则该单份标本3项联合NAT检测阳性。所有NAT阳性标本进行HBV DNA定量检测，未检出HBV DNA，则HBV DNA检测阴性，反之，则HBV DNA检测阳性。

1.3.4 血清乙肝标志物检测HBV DNA阳性样本采用Roche ELECSYS2010全自动免疫电化学发光分析仪配套试剂进行乙肝五项血清标志物检测。

1.3.5 HBV测序分型(1)HBV DNA定量检测：选取200份HBsAg阳性标本采用单人份检测模式进行HBV DNA定量检测：分别吸取650μl标本在COBASRAmpliPrep/COBASRTaqMan平台上进行检测，未检出HBV DNA,则该标本HBV DNA阴性，检出HBV DNA,则直接报HBV DNA定量结果。(2) HBV DNA阳性样本序列分析用QIAamp DNA blood mini kit从HBV DNA阳性标本中提取HBV DNA，按试剂说明书操作，最后以50μl水溶解，A260/280值为1.8～2.1，通过分析比较GENBANK中已公布的已知基因型的HBV S区序列，根据其保守区域设计出4条引物(表1)，用于该序列的巢式PCR扩增。

反应体系:10×buffer2.0μl，上游引物0.4μl，下游引物0.4μl，dNTP0.8μl，Taq酶0.2μl，ddH2O 11.2μl，模板5.0μl。反应条件:95℃预变性2min、94℃变性30 s、56℃退火30 s、72℃延伸3min，40个循环，72℃延伸10min。2轮PCR反应体系和反应条件相同。扩增产物鉴定:PCR结束后取产物5μl，经1.5%琼脂糖凝胶，100V电泳30min，溴化乙锭染色，凝胶成像系统观察结果。用DL2000作为Marker判断产物分子量大小。PCR扩增产物经切胶纯化后用第2轮扩增引物作为测序引物做双向测序。测序结果用ClustalⅩ与标准株比对，分析序列变异情况，用Mega 4.0软件作进化树分析，确定HBV基因型。

表1 HBV S区扩增引物

1.3.6 统计学分析用SPSS 16.0软件进行统计学分析，采用χ2检验组间率的比较，P<0.05为差异具统计学意义。

2 结果

2.1 献血者HBV感染情况64 400份HBsAg快筛合格献血者标本中，ELISA法共检出HBsAg阳性862份，阳性率为1.34%。63538份HBsAg筛查阴性样本中共检测出NAT阳性139份，其中HBV DNA阳性84份，献血者HBV感染率为1.47%，HBV输血感染隐匿风险率为0.13%；HBsAg筛查阴性样本中HBV DNA以低病毒载量为主，定量结果多＜20IU/ml的(70.2%)(见表2)。

表2 84份HBV DNA阳性标本病毒载量

2.2 NAT阳性标本中HBV感染模式通过对84份HBV DNA阳性标本血清乙肝标志物检测分析，共发现可疑窗口期感染6人份(占7.1%)，隐匿性感染63人份(占75.0%)、其他15人份(17.9%)，见表3。

2.3 献血者中HBsAg阳性人群HBV DNA定量检测随机选取ELISA法检测HBsAg阳性标本200人份，共检出HBV DNA阳性118人份，阳性率为59.0%，其中定量结果显示≤102IU/ml者占69.5%(82/118)。

HBsAgHBsAbHBeAgHBeAbHBcAb＜20≥20～＜102≥102人份(%)感染状况HBV DNA定量/(IU/ml) -------+ + + ---+ + + --+ + ------+ -----+ --+ -+ -+ -+ + -+ + + + -+ 4 9 2 0 0 1 0 6 1 8 0 1 1 3 9 2 0 2 0 4 0 1 1 0 0 0 0 1 0 0 1 0 6(7.1) 12(14.3) 29(34.5) 2(2.4) 10(11.9) 9(10.7) 1(1.2) 12(14.3) 1(1.2) 2(2.4)可疑窗口期隐匿性感染隐匿性感染隐匿性感染隐匿性感染隐匿性感染隐匿性感染其他(HBsAg+)其他(HBsAg+)其他(HBsAg+)

2.4 HBV基因分型148份HBV DNA阳性献血者中有66例成功测序分型，检出B基因型为47人份(71.2%，47/66)，C基因型为19人份(28.8%，19/ 66)，未检出其它基因型。

3 讨论

我国是HBV感染高流行国家，一般人群HB-sAg携带率为7.18%，其中江西地区13.12%[6]，因此，HBV感染仍是威胁我国输血安全的重要因素之一。目前，我国采供血机构主要采用ELISA法进行HBsAg筛查，其试剂灵敏度可达0.1～0.2ng/ml[7]，故绝大部分HBV感染献血者被排除在外。由于ELISA法存在一定的方法局限性，且HBV感染者免疫状态存在多样性，如OBI、病毒变异、感染窗口期等[8]，可致献血者体内存在一定程度的低病毒载量HBV DNA复制而出现漏检。若输注了该类血液制品，能否感染HBV取决于病毒载量、机体免疫状态、计划免疫等多方面因素，有输注含HBV DNA的HBsAg阴性献血者血液致输血后HBV感染的个例报道，因此有必要在常规血液筛查的基础上增加HBV DNA检测[9，10]。

目前全国血站核酸检测工作已逐步在各地区普及，主要采用NAT筛查血液中是否存在HBV DNA/HCV RNA/HIV RNA，在降低输血后HBV感染风险方面具有灵敏度高、特异性强的优势。报道数据表明我国献血者经HBsAg筛查后的HBV DNA检出率为1/10000～2/1000，高于美国、德国、日本等发达国家[4,5,11-14]，且地区间差异较大。本研究ELISA法HBsAg检测阴性标本HBV DNA阳性率为0.13%，略高于国内的报道数据，与地属HBV感染高流行地区有关；其血清乙型肝炎标志物检测提示多为隐匿性感染，病毒载量多以＜20IU/ml为主。因此，综合HBsAg ELISA法和NAT两种血液筛查模式，可最大限度的降低输血后感染风险，从而进一步提高输血安全性。

根据HBV DNA全基因序列异源性≥8%或S基因序列异源性≥4%的原则，HBV基因型可分为A-J 10种基因型[15，16]，报道显示我国A、B、C、D基因型均有分布，其中以B、C基因型为主，北方地区以C基因型为主，南方地区以B基因型为主，且随地区维度增加，C基因型分布增加，B基因型分布降低，地区间由于人群类别的关系，基因型分布差异较大，其中江西地区的报道数据为B基因型约70%～90%，C基因型为10%～20%不等，D基因型少见，约占1%[17-19]。本研究选取的148 HBV DNA阳性标本中，66份测序分型成功，成功率略低主要与绝大部份HBV感染的献血参与者被排除，检测者病毒载量低，提取难度大有关；测序结果显示以B基因型为主(71.2%，47/66)，C基因型次之，数据略低于以往报道数据，这与南昌地区献血者人群特点有关，但也不排除研究样本选取偏差因素。

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R193.9,R512.6+2

A

1674-1129(2014)04-0386-03

10.3969/j.issn.1674-1129.2014.04.007

钱榕，女，出生于1962年7月，硕士学位，副主任技师、医学检验专业、采供血管理研究。

2014-05-14；

2014-06-04)

江西省科技厅课题项目(编号:20122BBG70115)