高压氧预处理对老龄大鼠全脑缺血再灌注损伤后神经可塑性的影响*

邹 磊，刘丹彦，殷 薇，宋 云

(重庆医科大学附属第一医院麻醉科 400016)

研究表明，高压氧预处理可改善脑缺血再灌注损伤后大鼠的神经功能，但其机制尚不清楚[1-2]。缺血再灌注损伤后神经功能降低与神经再生修复能力降低有关，而轴突生长抑制因子(Nogo) mRNA编码的Nogo-A蛋白被认为是迄今发现最强的神经再生抑制物，其表达增强，损伤神经的再生修复能力降低[3-4]。因此本实验拟研究高压氧预处理对老龄大鼠全脑缺血再灌注损伤时Nogo mRNA、Nogo-A蛋白表达的影响以及从形态学上观察脑组织损伤情况，以探讨其改善神经功能的可能机制。

1 材料与方法

1.1 实验动物 雄性SD大鼠42只，月龄14个月，体质量480～530 g，由重庆医科大学实验动物中心提供。分为4组：对照组(C组，n=6)、高压氧组(H组，n=12)、脑缺血再灌注损伤组(I/R组，n=12)和高压氧预处理+脑缺血再灌注损伤组(HOP组，n=12)。H组和HOP组大鼠放入单个鼠笼置于YLC 0.5/1A型婴儿高压氧舱(武汉船舶设计研究所)，密闭舱门，调整进气与排气阀门，维持外界环境大气压，氧流量约5 L/min 洗舱5 min，关闭排气阀，调整进气阀使舱内压力在10 min内匀速上升至0.2 MPa，稳压1 h，关闭进气阀打开排气阀，为预防减压病以0.01 MPa/min速率匀速减压至0.15 MPa，维持5 min后再匀速减压至外界环境大气压。连续5 d,最后1次高压氧处理后24 h时I/R组和HOP组采用改良Pulsinelli四血管闭塞法制备大鼠脑缺血再灌注损伤模型。

1.2 方法

1.2.1 建立模型方法 参照文献[5]采用改良Pulsinelli四血管闭塞法制备大鼠脑缺血再灌注损伤模型。将大鼠用10%的水合氯醛(3 mL/kg)腹腔麻醉后，固定于单臂脑立体定位仪(Stoelting公司，美国)上，开颅，沿大鼠枕骨大孔向下，向两侧分离肌肉和筋膜，充分暴露第一颈椎侧翼小孔，显微镜直视下采用直径0.5 mm电凝针灼断双侧椎动脉，造成永久性闭塞，然后缝合切口，24 h后再次麻醉大鼠，取仰卧位固定于自制手术台上，颈前切口游离双侧颈总动脉，无创动脉夹夹闭10 min后松开行再灌注。逐层缝合肌肉、皮肤，充分消毒。手术过程中用日光灯(100 W)照射，维持大鼠体温。大鼠自主呼吸存在，双侧瞳孔散大，对光反射消失，脑电图显示呈等电位直线为模型制备成功。

1.2.2 影像学检查 C组、H组麻醉后，I/R组、HOP组在建立急性全脑缺血模型1 h后进行影像学检查。大鼠取仰卧位于固定板，3英寸环形表面线圈置于固定板上。先行3平面定位扫描，然后分别行横断位及冠状位T1WI、T2WI扫描。T1WI:SE序列，TR=300 ms，TE=10.0 ms，层厚3 mm，间隔1 mm，FOV 8 cm×8 cm，矩阵256 × 224。T2WI：FRFSE序列，TR=3 600 ms，TE=123.8 ms，层厚3 mm，间隔1 mm，FOV 8 cm ×6 cm，矩阵256 ×224。4组大鼠均按照上述方法行MRI检查，观察梗死面积。

1.2.3 Nogo mRNA检测 H组、I/R组和HOP组于再灌注24 h时随机取6只大鼠，用10%的水合氯醛(3 mL/kg)腹腔麻醉后，快速断头开颅取全脑组织，在蒸馏水制成的冰面上分离大脑皮质，用锡铂纸标记包裹后置于液氮中过夜，然后保存于-70 ℃超低温冰箱中待用。C组大鼠水迷宫实验后采集标本。按照试剂盒(北京天根生化科技公司)操作说明提取RNA,Premier 5.0软件设计并合成目的基因及管家基因的上下游引物。 Nogo-A mRNA上游引物：5′-GCT CTG GAG CTG TCC TTC ACA GTT-3′，下游引物：5′-AGT CTT CTC TGT TAT AAT TTG GG-3′，扩增产物300 bp；以Rat GAPDH为内参，上游引物：5′-TCA CCA CCG TGG AGA ACG C-3′，下游引物：5′-GCT AAG CAG TTG GTA GTT CA-3′，扩增产物229 bp。首先进行常规一步法RT-PCR，将其产物作为母液做10个梯度稀释，取浓度最低的7个稀释样本运用Bio-Rad CFX96荧光定量PCR仪进行扩增，得到相对标准曲线。再从变性到延伸整个过程共40个循环，每个样本均重复3次。反应完毕行融解曲线及凝胶电泳分析以明确目的扩增片段及产物的特异性，最后得到相对标准曲线、融解曲线和样本的相对定量拷贝数，所得数据由Bio-Rad CFX96荧光定量PCR仪自带数据分析软件进行分析。

1.2.4 Nogo-A蛋白检测 Western blot法采用北京博奥森公司辣根过氧化物酶标记羊抗兔Nogo-A。取冻存脑组织用生理盐水匀浆后，加入1 mL蛋白裂解液，于4 ℃低温12 000 r/min离心(离心半径8 cm)15 min，取上清液，测定蛋白质的浓度并调整为1～2 μg/μL，进行蛋白质的凝胶电泳。整个过程严格按照说明书进行，用凝胶图像处理系统分析目标条带的相对分子质量和净光密度值。

2 结 果

2.1 Nogo mRNA与Nogo-A蛋白表达 与C组比较,I/R组和HOP组Nogo mRNA及Nogo-A蛋白表达上调(P<0.05)；与I/R组比较,H组和HOP组Nogo mRNA及Nogo-A蛋白表达下调(P<0.05)，见表1。

表1 各组大鼠脑组织Nogo mRNA、Nogo-A蛋白表达的比较

a：P<0.05，与C组比较；b：P<0.05，与I/R组比较。

2.2 影像学结果 C组、H组大脑未见明显缺血梗死灶；I/R组双侧皮质区可见明显弧形缺血梗死区，T1WI呈低信号；T2WI呈明显高信号，HOP组双侧皮质区也可见弧形缺血梗死区，面积较I/R组小，T1WI呈等低信号，T2WI呈略高信号，见图1。

A:C组；B:H组;C:I/R组；D:HOP组。

图1 4组大鼠大脑皮质MRI检查结果

3 讨 论

本研究采用改良Pulsinelli四血管闭塞法建立全脑缺血模型[5],成功地模拟了临床上休克、心功能不全、脑血管严重狭窄或阻塞合并血液低灌流引起的脑血流循环障碍，以及由此造成的不同程度脑组织急性缺血缺氧损伤。本实验选择阻断双侧颈动脉的时间为10 min，能造成中等程度脑缺血损害而又不至于使所建立模型死亡率升高。参照文献[6]及预实验结果，本实验选择连续5 d高压氧预处理(每天置于高压氧舱内1 h，氧压为0.2 MPa)的方法进行研究。

通过本研究MRI检查发现，给予连续高压氧预适应能减少建模后老龄大鼠大脑皮质超急性期缺血梗死面积，从形态学上证明高压氧预适应有脑保护作用。脑缺血预适应是指对脑组织采用各种措施，如一次或多次短暂性缺血再灌注后，诱导组织产生内源性保护机制，即机体对短暂缺血的适应性反应，能增加组织细胞对再次缺血的耐受性[7]。研究表明，预处理能激发脑组织产生自身内源性保护物质如神经营养因子和腺苷受体激动剂[8]，增加神经源中热休克蛋白的表达等多种途径[9]，从而产生脑保护作用。

研究表明，脑缺血再灌注损伤后神经可塑性的下降是影响神经功能恢复的主要因素[10]，而脑组织Nogo mRNA表达上调，使其编码的蛋白表达增加可导致神经再生修复能力降[4]。正常情况下Nogo mRNA及Nogo-A蛋白主要在脑皮质、海马等部位中等强度表达，在急性损伤(如缺血缺氧、脑挫伤等)后表达上调[11]。而大脑皮质对缺血最为敏感，因此，有研究推测脑缺血损伤后脑皮质Nogo-A表达上调，导致神经可塑性降低，再生修复能力降低[12-14]。本研究发现，I/R组Nogo mRNA 及Nogo-A蛋白表达上调，同时大脑缺血梗死面积增大。

有报道表明，缺血再灌注损伤后进行高压氧处理可下调Nogo-A表达，促进损伤神经再生修复[15]。本研究结果显示，与C组比较，I/R组和HOP组脑皮质Nogo mRNA 及Nogo-A蛋白表达上调，提示高压氧预处理同样可能通过抑制脑皮质Nogo mRNA及Nogo-A蛋白表达上调，改善脑缺血再灌注损伤后老龄大鼠大脑的修复能力。本研究结果还提示，C组和H组脑皮质Nogo mRNA和Nogo-A蛋白表达差异无统计学意义，提示单纯高压氧虽然是一种非生理状态的刺激，但对老龄大鼠脑的正常功能无影响。

综上所述，高压氧预处理通过抑制大脑皮质Nogo-A蛋白过度表达，提高神经可塑性，增加再生修复能力，从而减轻缺血再灌注损伤时脑梗死程度。

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