三七总皂苷诱导U937细胞凋亡及对Caspase-3表达的影响

目的观察三七总皂苷（PNS）对人急性单核细胞白血病细胞系U937细胞的增殖、凋亡及Caspase-3表达的影响。方法用不同浓度PNS作用于U937细胞，采用MTT法检测细胞增殖活性，用流式细胞术检测细胞周期和凋亡，Western-blot法检测Caspase-3蛋白表达。结果PNS抑制U943细胞生长并呈时间和剂量依赖性；分别予100、200、400、800mg/L处理U937细胞48h，细胞凋亡率分别为（5.93±0.15）%、（7.43±0.70）%、（12.3±0.38）%和（20.4±0.91）%，对照组细胞凋亡率为（1.73±1.50）%（P＜0.01），并诱导细胞G1期阻滞；Western-blot结果显示，PNS使Caspase-3蛋白表达上调。结论PNS能抑制U937细胞增殖，并可能通过上调Caspase-3蛋白表达诱导细胞凋亡。

三七总皂苷；U937细胞；凋亡；Caspase-3

三七总皂苷（panax notoginseng saponis，PNS）是从五加科人参属多年生草本植物三七中提取的主要有效成分，有活血祛瘀，活络通脉等功效。近年来，许多实验及临床研究发现，PNS对肝癌、胃癌、前列腺癌、妇科肿瘤、黑色素瘤、乳腺癌等多种肿瘤具有抗肿瘤作用[1-5]。但PNS对人急性单核细胞白血病的研究资料甚少。本文采用不同浓度PNS作用于人急性单核细胞白血病细胞系U937，观察其对U937细胞增殖及凋亡的影响，为进一步研究PNS抗白血病作用提供实验依据，旨在扩展急性髓性白血病的辅助治疗方法。

1 实验材料

1.1药物及材料 人急性单核细胞白血病细胞系U937细胞由本实验室保存；PNS冻干粉针剂购自广西梧州制药有限公司；IMDM培养基购自Gibco公司；新生牛血清购自杭州四季青公司；二甲基亚砜（DSMO）、四甲基偶氨唑蓝（MTT）购自Sigma公司；细胞凋亡和细胞周期检测试剂盒购自Invitrogen公司；一抗购自Santa Crusz公司。

1.2主要仪器及设备 二氧化碳培养箱（Thermo），酶标仪（BioTek，ELx808IU），流式细胞仪（BD），电泳槽、电泳仪、蛋白转印系统（Bio-Rad）

2 实验方法

2.1细胞培养 将U937细胞接种于含10%新生牛血清的IMDM培养液中，37℃，5%CO2，饱和湿度培养箱中培养。每2～3天换液1次，取对数生长期的细胞进行实验。

2.2分 组 设实验组和空白对照组。PNS按剂量不同分为50、100、200、400、800、1600、3200mg/L七组，未加药组为对照组。

2.3细胞生长抑制率测定 采用噻唑蓝（MTT）还原法进行检测。将1×105/mL浓度的U937细胞接种于96孔培养板内，每孔200μL，每组设6个平行孔。分别作用于24、48、72h后，加入MTT（浓度5mg/mL），继续培养4h，吸去上清液，每孔加入DMSO150μL，在自动酶标仪上进行比色（测试波长490nm），自动记录每孔吸光度（D）值，计算不同浓度PNS对U937细胞的生长抑制率：抑制率（%）=[（对照组OD值-实验组OD值）/对照组OD值]×100%。

2.4流式细胞术（FCM）检测细胞周期和凋亡率

收集U937细胞，离心1000rpm，5min，去培养基，冷PBS洗涤1次。用1×Annexin-binding buffer重悬细胞约1×106/mL，取100uL，加5μL Annexin V和1μL 100μg/mL PI，室温5min，加400μL1×Annexin-binding buffer，轻轻混匀，放于冰上，进行FCM分析。

2.5Western-blot法检测Caspase-3蛋白 收集细胞，PBS洗涤，抽提细胞裂解液。蛋白上样量40μg，SDS-PAGE电泳，硝酸纤维素膜转移，1%BSA封闭，1h。一抗1：1000稀释，1.5h；二抗1：8000稀释，1h，ECL显影。

2.6统计学方法 数据用（） 表示，应用SPSS10.0软件进行统计分析，组间比较采用t检验，P＜0.05表示差异有统计学意义。

3 实验结果

3.1PNS对U937细胞增殖的影响 PNS对U937细胞的生长有明显的抑制作用，并且随浓度增加，作用时间延长，细胞抑制率明显升高（P＜0.05）。不同浓度PNS作用于U937细胞48h，随着PNS浓度增加抑制率增加，100mg/L以上浓度可明显抑制U937细胞增殖（P＜0.01），见表1。

表1 PNS对U937细胞增殖的影响（n=3，）

表1 PNS对U937细胞增殖的影响（n=3，）

注：与对照组比较，*P＜0.01

?

3.2PNS对U937细胞周期和凋亡的影响 分别用100、200、400、800mg/L的PNS处理U937细胞48h后，诱导细胞G1期阻滞，停留于G1期的细胞增加，并诱导细胞凋亡，凋亡率分别为（5.93±0.15）%、（7.43±0.70）%、（12.3±0.38）%和（20.4±0.91）%，对照组细胞凋亡率为(1.73±1.50%)（P＜0.01），呈剂量依赖性方式，见表2，图1（封二）。

表2 不同浓度PNS作用于U937细胞后细胞周期分布（n=3，） %

表2 不同浓度PNS作用于U937细胞后细胞周期分布（n=3，） %

?

3.3PNS对U937细胞Caspase-3蛋白表达的影响

用不同浓度PNS作用于U937细胞72h，Caspase-3蛋白的表达随浓度增加逐渐上调，见图2（封二）。

4 讨论

肿瘤的发生、发展与细胞凋亡调控和细胞增殖调控紊乱密切相关。细胞凋亡即程序性细胞死亡，主要有线粒体途径、死亡受体介导途径和内质网应激介导途径。这三条途径最终都会激活Caspase-3，Caspase-3是细胞凋亡反应中的执行者和关键酶，直接参与介导细胞凋亡过程[6]。通过活化脱氧核糖核酸酶，引起细胞染色体断裂，发生细胞凋亡[7]。Caspase-3是真核细胞中的凋亡蛋白，属半胱氨酸蛋白酶家族成员之一，大多数的细胞凋亡与之相关[8]。

PNS是中药三七的主要成分，广泛应用于心血管系统、中枢神经系统、血液系统、免疫系统及抗衰老等方面[8-10]。近年来，随着国内外学者不断的深入研究，发现PNS具有多靶点抗肿瘤作用，可通过抑制肿瘤细胞生长、诱导肿瘤细胞凋亡和分化、逆转肿瘤多药耐药、增强机体免疫功能等多种方式发挥抗肿瘤作用[11-13]。

本实验用PNS作用于人急性单核细胞白血病细胞系U937细胞，实验结果显示，PNS可以有效抑制U937细胞增殖，细胞生长抑制作用随浓度增加及作用时间增加而增强。细胞周期分析显示，PNS可以使G1期细胞含量较对照组增高，显示G1期阻滞，并呈浓度依赖性。同时，PNS作用于U937细胞48h后，与对照组比较，100、200、400、800mg/L组均可显著诱导U937细胞的凋亡。PNS可以使U937细胞Caspase-3蛋白表达增强，并且随浓度增加蛋白表达增强。

本研究结果表明，PNS具抑制U937细胞增殖的作用，呈时间和浓度依赖性，并能够影响细胞周期，阻滞U937细胞于G1期，使Caspase-3蛋白表达增强，诱导细胞凋亡。

［1］程馥艳，刘锡文，徐晓武.三七总皂苷对人肝癌细胞HepG2移植瘤增殖的影响及其机制的研究［J］.河北医科大学学报，2011，32（4）：477-449.

［2］李军祥，王志斌，朱陵群，等.三七提取物对MNNG转化后GES-1细胞的促凋亡作用［J］.中西医结合学报，2005，3（2）：123-127.

［3］刘丽丽，刘艳娥，房国涛.三七总皂苷逆转乳腺癌细胞MCF-7/ADM多药耐药的实验研究［J］.时珍国医国药，2008，19（4）：954-956.

［4］杨芬，刘浩，余美玲，等.三七粉对小鼠S180移植肿瘤的抑制作用及免疫功能的影响［J］.蚌埠医学院学报，2009，34（3）：195-197.

［5］Zhou P，Chou J，Olea RS，et al.Solution structure of Apaf-1 CARD and its interaction with Caspase-9 CARD：a structural basis for specific adaptor/Caspase interaction［J］.Proc Natl Acad Sci，1999，96（6）：11265-11270.

［6］Cahen GM.Caspases：The executioners of apoptosis［J］.Biochem J，1997，326（1）：1-16.

［7］张剑峰，张丹参.三七总皂苷药理作用研究进展［J］.医学综述，2007，13（6）：472-474.

［8］张玉军.三七总皂苷的药理研究进展［J］.广西医学，2009，31（4）：589-590.

［9］万晓青.三七及其制剂在心血管疾病的应用［J］.浙江中西医结合杂志，2008，18（12）：776-777.

［10］周小宝.三七皂苷对大鼠脑缺血再灌注损伤细胞凋亡及相关基因表达的影响［J］.浙江中西医结合杂志，2009，19（1）：15-17

［11］张翠玲，余美玲，陶亮，等.三七总皂苷对环磷酰胺的增效减毒作用［J］.南京中医药大学学报，2008，24（4）：254-256.

［12］Morjani H，Madoulet C.Immunosuppressors as multidrug resistance reversal agents［J］.Methods Mol Biol，2010，596（6）：433-446.

［13］Coley HM.Overcoming multidrug resistance in cancer:clinical studies of p-glycoprotein inhibitors［J］.Methods Mol Biol，2010，596（6）：341-358.

三七总皂苷诱导U937细胞凋亡及对Caspase-3表达的影响

王 潇 陈小红 尹利明 高瑞兰 浙江省中医院 杭州310006

Effect of Panax Notoginseng Saponis on Apoptosis of and Caspase-3 in U937 cells

WANG Xiao，CHEN Xiaohong，YIN Liming，GAO Ruilan.Zhejiang Provincial Hospital of TCM,Hangzhou(310006),China

ObjectiveTo investigate the effect of panax notoginseng saponis（PNS）on proliferation and apoptosis of human acute monocytic leukemia cell line U937 and the expression of caspase-3 in it.MethodsU937 cells were treated with PNS at different concentrations.Cell proliferation was analyzed by MTT assay.Cell cycle and apoptosis was assessed by flow cytometry,and the expression of Caspase-3 protein was detected by Western blot.ResultsThe inhibition of cell proliferation in U937 cells exposed to PNS was in a dose and time dependent manner.At 48 hours after exposure to 100，200，400，800 mg/L PNS，the apoptotic rates of U937 cells were（5.93± 0.15）%，（7.43±0.70）%，（12.3±0.38）%and（20.4±0.91）%，respectively，which were markedly higher than that of control group（1.73±1.50%，P＜0.01）.The exposure to PNS induced the G1 phase arrest of U937 cells and up-regulated the expression of Caspase-3 protein in U937 cells.ConclusionPNS can inhibit the proliferation of U937 cells and induce apoptosis by up-regulating the expression of Caspase-3.

panax notoginseng saponis；U937 cells；apoptosis；Caspase-3

2013-12-23

2014-02-13

·临床报道·