脐带间充质干细胞治疗多系统萎缩小脑型的安全性及疗效研究

刘 静 韩冬梅 丁 丽 薛 梅 王志东 阎洪敏 朱 玲 郑晓丽 董 磊 郭子宽 王恒湘

脐带间充质干细胞治疗多系统萎缩小脑型的安全性及疗效研究

刘 静 韩冬梅 丁 丽 薛 梅 王志东 阎洪敏 朱 玲 郑晓丽 董 磊 郭子宽 王恒湘

目的观察脐带间充质干细胞（UC-MSCs）鞘内注射，治疗多系统萎缩小脑型（MSA-C）的安全性及临床疗效。方法自2009年12月至2012年4月，对40例MSA-C患者给予UC-MSCs鞘内注射治疗，每次每Kg体重给予1×106个细胞，1次/周，4次为1个疗程。本组中29例治疗1个疗程，9例患者治疗2个疗程，2例患者治疗3个疗程。采用世界神经病联合会国际合作共济失调评分量表（ICARS）及日常生活量表（ADL）对患者治疗前后的神经功能进行评定。治疗后对患者进行随访。结果40例MSA-C患者共53个疗程，其中47疗程有效（有效率88.68%）。11例接受多疗程治疗的患者中，9例在后续疗程中疗效进一步提高。治疗结束1个月后ICARS及ADL均比治疗前明显降低（P＜0.01）。治疗有效患者多表现为行走、站立不稳，运动迟缓，上肢精细动作障碍，书写困难，构音障碍，眼球运动障碍等临床症状得到改善。治疗后常见的不良反应有头晕（4例）、腰痛（1例）、头痛（2例）、发热（2例），均在1～3 d内消失。随访27～55个月（中位随访时间40个月），无治疗相关的副作用发生，有效患者疾病稳定时间为2～13个月（平均5.88±2.86个月），之后疾病再次出现进展。结论UC-MSC鞘内注射治疗是安全的，可在一定程度上改善MSA-C患者的临床症状，多疗程治疗有助于多数患者神经功能的进一步改善，延缓疾病进展。

脐带间充质干细胞多系统萎缩鞘内注射

多系统萎缩小脑型（MSA-C）是以小脑共济运动障碍为主要临床表现的中枢神经系统变性疾病，最常累及的部位为小脑，还可累及橄榄核、脑桥、脊髓等部位。临床表现为行走、站立不稳，上肢精细动作差，构音障碍，意向震颤等。病情呈进行性进展，最后丧失自主生活能力，给家庭、社会带来极大负担。药物治疗效果欠佳。而脐带间充质干细胞（UCMSCs）来源于脐带，易获取，体外能够大量扩增，低免疫原性，具有横向分化潜能，适当条件下可向外胚层的神经细胞分化。我们采用UC-MSCs鞘内注射治疗40例MSA-C患者，取得一定疗效。

1 材料与方法

1.1 对象

2009年7月至2013年8月，40例MSA-C患者经头颅MRI检查及临床表现确诊。男24例，女16例，平均年龄53岁（23岁～74岁），起病时平均年龄49岁（20岁～71岁），平均病程4年（3个月～15年）。治疗前如实告知患者治疗方案及风险，患者均签署知情同意书，治疗方案经医院医学伦理委员会批准。所有患者均无干细胞治疗禁忌症，如发热、感染、凝血功能及重要脏器功能障碍等。术前对患者进行总体评估，包括体格检查、ECG、头颅MRI检查，以及血、尿、便常规和肝肾功能、凝血象、手术感染八项检查等。

1.2 方法

1.2.1 UC-MSCs的制备

按文献[1]提供的方法，稍加改良后进行UCMSCs的制备。简言之，经知情同意及感染源检定后收集脐带，去除外膜和动静脉，将脐带剪成0.5 cm3大小的组织块，加入等体积0.2%Ⅰ型胶原酶，37℃消化过夜。次日，加入两倍体积的0.05%的胰蛋白酶，37℃消化1 h。2 000 r/min离心10 min收集细胞，计活细胞数。将细胞悬浮于人MSC无血清培养基（杭州百威）中，按1×106cells/cm2底面积接种于塑料培养瓶中。1周后出现数十个形态类似于成纤维细胞的细胞集落，加入0.05%胰蛋白酶消化，并按6 000 cells/cm2底面积进行传代培养。利用流式细胞术测定细胞表型，常规感染源检定后，收集细胞用于治疗。或收获细胞放于-80℃冰箱冻存备用，用前，在37℃环境下快速复苏，24～48 h培养，收获贴壁生长的细胞供临床应用。

1.2.2 UC-MSCs鞘内注射

入院第3或第4天，患者行腰穿，鞘内注射UC-MSCs，1次/周，4次为1个疗程。按诊疗常规进行腰穿，每次将UC-MSCs 10 mL（1×106cells/Kg）+地塞米松5 mg在10 min内缓慢注入蛛网膜下腔，拔针，敷以无菌辅料，嘱患者去枕平卧6 h。治疗有效患者在半年后可接受下一疗程治疗。共29例患者接受1疗程治疗，9例接受2疗程治疗，2例接受3疗程治疗。本组所有患者均辅以系统康复锻炼。

1.2.3 评估标准

采用世界神经病联合会国际合作共济失调评分量表（ICARS）[2]及日常生活量表（ADL）[3]对患者治疗前及治疗后1个月的神经功能及生活质量进行评定，分值越高表示神经功能缺损越严重。

1.2.4 不良反应及并发症观察

观察治疗中及治疗后有无发热、腰痛、头痛、头晕等不良反应。

1.2.5 统计学分析

采用SPSS 11.5软件包进行统计处理，计量资料以均数±标准差表示，治疗前后的比较采用配对t检验，P＜0.05为差异有统计学意义。

2 结果

2.1 临床疗效

40例MSA-C患者共53个疗程治疗中，47个疗程有效（有效率88.68%），无效的6个疗程中4个疗程发生于接受第1个疗程治疗的患者，2个疗程发生于接受第2个疗程治疗的患者。11例接受2个或3个疗程治疗的患者中，9例在后续疗程治疗中神经系统功能获得进一步改善。

40例MSA-C患者53个疗程治疗结束1个月与治疗前比较，ICARS、ADL评分明显降低，差异有统计学意义（表1）。

MSA-C患者53个疗程治疗结束1个月与治疗前ICARS各单项评分比较：姿势和步态障碍、动态功能（共济运动、描图）障碍、语言障碍、眼球运动障碍，具有显著差异（表2）。治疗有效患者多表现为行走、站立不稳，运动迟缓，上肢精细动作障碍，书写困难，构音障碍，眼球运动障碍等临床症状得到改善。有效的44个疗程中，姿势和步态改善39例次，动态功能（共济运动、描图）改善38例次，语言障碍改善7例次，眼球运动障碍改善6例次。

表1 患者治疗前后ICARS及ADL评分Table1 ICARS and ADL score before and after treatment

表2 患者治疗前后ICARS中各单项评分Table2 Each single score of ICARS before and after treatment

2.2 不良反应及并发症

UC-MSCs治疗中及治疗后，患者的生命体征平稳。4例腰穿后去枕平卧时感头晕，起来后症状逐渐消失。1例治疗后感腰痛，2例头痛，2例发热，未经特殊处理，1～3 d后症状消失。头痛患者表现为立位、坐位、活动时头痛加重，卧位时头痛减轻或消失，考虑系腰穿术后出现低颅压综合征，在后续治疗中通过增加鞘注液体量至15 mL缓慢鞘注后,未再出现头痛。所有患者均无其他不良反应。

2.3 随访

所有患者随访27～55个月，中位随访时间40个月。随访期间无治疗相关不良事件发生，治疗有效患者疾病稳定时间为2～13个月，平均5.88±2.86个月，之后疾病出现进展。

3 讨论

多系统萎缩（MSA）是一组原因不明的，累及小脑、脑干、锥体外系和自主神经系统的神经系统变性疾病。50～60岁发病多见，男多于女，为散发，无遗传性。疾病进行性发展，出现运动不能、震颤、平衡障碍、体位性低血压、痴呆等症状，预后差，多在发病后2～5年内部分或全部失去自主生活能力[4]，存活期7～9年，少数病例存活时间超过15年[5-6]。少突胶质细胞的胞质α-突触共核蛋白阳性包涵体是MSA的神经病理学特征，α-突触共核蛋白的异常聚集诱发神经元变性，因此该病被归于α-突触共核蛋白病[6-7]。MSA以MSA-C多见，MSA-C小脑及脑干萎缩更为显著，以小脑性共济失调为主要表现。这种神经功能的丧失不能被逆转，迄今尚无有效的治疗方法。

间充质干细胞（MSCs）具有多向分化的潜能，在适宜条件下能向神经细胞方向分化[8]，并可分泌大量的生物活性物质[9]，在修复中枢神经系统损伤和疾病方面具有潜在作用。动物实验已证明，移植人UC-MSCs治疗脊髓损伤（SCI）、神经变性疾病（帕金森氏病、MSA、共济失调、阿尔海默次病、多发性硬化）模型大鼠及中风模型大鼠，可改善其神经功能，人UC-MSCs分泌的各种神经营养因子在神经损伤修复中起到重要作用[10-17]。在临床试验中，Lee等[18]采用自体骨髓MSCs动脉或静脉输注给22例MSA-C患者，经过12个月的观察，与对照组相比，症状得到明显改善，在一定时期内延迟了疾病的进展。在前期的临床试验中，我们采用UC-MSCs鞘内注射治疗22例脊髓损伤（SCI）患者，结果显示治疗是安全的，6例完全性SCI患者均无效，16例不完全性SCI患者有效率达81.25%，其中5例有效患者接受了2个或3个疗程治疗，疗效均有进一步的提高[19]。我们对14例SCA及10例MSA-C患者给予UC-MSC鞘内注射治疗，除1例MSA患者外，余患者神经功能均获得一定程度改善，且不良反应轻，均能自行恢复[20]。本试验对40例MSA-C患者采用UC-MSCs鞘内注射治疗53个疗程，治疗有效率达88.68%，治疗有效患者的神经功能得到一定程度改善，表现为行走、站立不稳，运动迟缓，上肢精细动作障碍，书写困难，构音障碍，眼球运动障碍等临床表现得到改善。治疗是安全的，有效患者疾病稳定时间在半年左右（2～13个月），多疗程治疗有助于多数患者神经功能的进一步改善，延缓疾病进展。

UC-MSCs来源于人脐带华尔通胶，具有取材容易、含量丰富、在体外能够大量扩增的优势[21]，还可将其冻存，应用前复苏，短时间内即可收获足够量的细胞用于临床治疗。其高表达CD105、CD73、CD90，不表达CD45、CD34、CD14、CD19以及与移植排斥相关的HLA-DR，在体外长期培养过程中能保持其多向分化潜能，在特定条件下能分化为神经细胞，表达神经细胞的相关标记和基因，具有低免疫原性，异基因移植不会发生免疫排斥反应，作为组织工程研究的种子细胞具有广阔的应用前景[8，16，22]。

MSCs所介导的神经保护和神经再生的作用机制在许多临床试验中得到阐述，MSCs可能通过迁移到损伤部位，分化和替代损伤及死亡的神经细胞[16，23]，并分泌多种神经营养因子，包括脑源性神经营养因子（BDNF）、胶质源性神经营养因子（GDNF）、神经生长因子（NGF）、血管内皮细胞生长因子（VEGF）、成纤维细胞生长因子（FGF）、胰岛素样生长因子(IGF)、肝细胞生长因子（HGF）等促进血管及神经再生，减少神经细胞凋亡[11，23]，亦可通过免疫调控机制抑制慢性炎性反应[13，16－17，23]。

本研究表明，UC-MSCs鞘内注射治疗MSA-C是安全的，随访27～55个月，未发现有治疗相关的不良事件发生。MSA-C属进展性神经变性疾病，UC-MSCs治疗只能在一定时间内改善症状、延缓疾病进展。治疗有效患者通过间歇性多疗程治疗可以延缓疾病进展。至于每疗程的最佳治疗次数、间歇时间、最佳的鞘注MSCs数量、最好的治疗途径等，还需要大宗病例的随机对照研究。

[1]Avanzini MA,Bernardo ME,Cometa AM,et al.Generation of mesenchymal stromal cells in the presence of platelet lysate:a phenotypic and functional comparison of umbilical cord bloodand bone marrow-derived progenitors[J].Haematologica,2009,94 (12):1649-1660.

[2]黄红云.中枢神经修复学[M].北京:科学出版社,2009,479-482.

[3]日常生活能力量表(ADL)[J].中国微侵袭神经外科杂志,2006,11 (11):516.

[4]Jellinger KA,Seppi K,Wenning GK.Grading of neuropathology in multiple system atrophy:proposal for a novel scale[J].Mov Disord,2005,20(Suppl 12):S29-S36.

[5]Jamora RD,Gupta A,Tan AK,et al.Clinical characteristics of patients with multiple system atrophy in Singapore[J].Ann Azad Med Singapore,2005,34(9):553-557.

[6]Ubhi K,Low P,Masliah E.Multiple system atrophy:a clinical and neuropathological perspective[J].Trends Neurosci,2011,34 (11):581-590.

[7]Wenning GK,Stefanova N.Recent developments in multiple system atrophy[J].J Neurol,2009,256(11):1791-1808.

[8]Messerli M,Wagner A,Sager R,et al.Stem cells from umbilical cord wharton's jelly from preterm birth have neuroglial differentiation potential[J].Reprod Sci,2013,20(12):1455-1464.

[9]Momin EN,Mohyeldin A,Zaidi HA,et al.Mesenchymal stem cells:new approaches for the treatment of neurological diseases [J].Curr Stem Cell Res Ther,2010,5(4):326-344.

[10]Hu SL,Luo HS,Li JT,et al.Functional recovery in acute traumatic spinal cord injury after transplantation of human umbilical cord mesenchymal stem cells[J].Crit Care Med,2010,38(11):2181-2189.

[11]Glavaski-Joksimovic A,Bohn MC.Mesenchymal stem cells and neuroregeneration in Parkinson's disease[J].Exp Neurol,2013, 247:25-38.

[12]Park HJ,Bang G,Lee BR,et al.Neuroprotective effect of human mesenchymal stem cells in an animal model of double toxininduced multiple system atrophy parkinsonism[J].Cell Transplant, 2011,20(6):827-835.

[13]Stemberger S,Jamnig A,Stefanova N,et al.Mesenchymal stem cells in a transgenic mouse model of multiple system atrophy: immunomodulation and neuroprotection[J].PLoS One,2011,6(5): e19808.

[14]Zhang MJ,Sun JJ,Qian L,et al.Human umbilical mesenchymal stem cells enhance the expression of neurotrophic factors and protect ataxic mice[J].Brain Res,2011,1402:122-131.

[15]Lin YC,Ko TL,Shih YH,et al.Human umbilical mesenchymal stem cells promote recovery after ischemic stroke[J].Stroke, 2011,42(7):2045-2053.

[16]Dalous J,Larghero J,Baud O.Transplantation of umbilical cordderived mesenchymal stem cells as a novel strategy to protect the central nervous system:technical aspects,preclinical studies,and clinical perspectives[J].Pediatr Res,2012,71(4):482-490.

[17]El Omar R,Beroud J,Stoltz JF,et al.Umbilical cord mesenchymal stem cells:the new gold standard for mesenchymal stem cell based therapies[J]?Tissue Eng Part B Rev,2014,20(5):523-544.

[18]Lee PH,Lee JE,Kim HS,et al.A randomized trial of mesenchymal stem cells in multiple system atrophy[J].Ann Neurol,2012,72(1): 32-40.

[19]Liu J,Han DM,Wang ZD,et al.Clinical analysis on the treatment of spinal cord injury with umbilical cord mesenchymal stem cells [J].Cytotherapy,2013,15(2):185-191.

[20]Dongmei H,Jing L,Mei X,et al.Clinical analysis of the treatment of spinocerebellar ataxia and multiple system atrophy-cerebellar type with umbilical cord mesenchymal stromal cells[J].Cytotherapy, 2011,13(8):913-917.

[21]Shetty P,Cooper K,Viswanarhan C.Comparison of proliferative and multilineage differentiation potentials of cord matrix,cord blood,and bone marrow mesenchymal stem cells[J].Asian J Transfus Sci,2010,4(1):14-24.

[22]Cho PS,Messina DJ,Hirsh EL,et al.Immunogenicity of umbilical cord tissue derived cells[J].Blood,2008,111(1):430-438.

[23]Paul G,Anisimov SV.The secretome of mesenchymal stem cells: Potential implications for neuroregeneration[J].Biochimie,2013, 95(12):2246-2256.

Effectiveness of Umbilical Cord Mesenchymal Stem Cells in Treating Multiple System Atrophy-Cerebellar Type

LIU Jing1,HAN Dongmei1,DING Li1,XUE Mei1,WANG Zhidong1,YAN Hongmin1,ZHU Ling1,ZHENG Xiaoli1,DONG Lei1, GUO Zikuan2,WANG Hengxiang1.
1 Department of Hematology,General Hospital of the Air Force,Beijing 100142,China;2 Department of Experimental Hematology,Beijing Institute of Radiation Medicine,Beijing 100850,China.Corresponding author: WANG Hengxiang(E-mail:wanghengxiang123@aliyun.com).

ObjectiveTo observe the effectiveness of intrathecal injection with umbilical cord mesenchymal stem cells (UC-MSCs)in treating multiple system atrophy-cerebellar type(MSA-C).MethodsFrom December 2009 to April 2012,40 patients with MSA-C were given UC-MSCs intrathecal injection with the dosage of 1×106cells/Kg for once a week,4 times as a course.Twenty-nine patients were treated with 1 course,9 patients with 2 courses and 2 patients with 3 courses. International Cooperative Ataxia Rating Scale(ICARS)and Activity of Daily Living Scale(ADL)were used to evaluate patients'neural function and ability of daily living.Patients were followed up after treatment.ResultsIn 53 courses,47 courses are effective(the effective rate was 88.68%).Compared with the ICARS and ADL scores before treatment,patients’scores were significantly decreased 1 month after treatment(P＜0.01).In most effective cases,clinical symptoms such as unstable walking and standing,slow movement,upper limb fine motor disorder,writing difficulties,dysarthria,eye movement disorders were improved.During treatment,common adverse effects were observed,as dizziness(4 cases),low back pain(1 cases),headache(2 case)and fever(2 cases),all these symptoms disappeared within 1-3 days.No treatment-related adverseevents were observed during 27-55 months(median 40 months)of follow-up.The stable effective period of patients ws 2-13 months(average 5.88±2.86 months),then progressed.ConclusionUC-MSCs intrathecal injection is safe,and can ameliorate clinical symptoms to some extent.Multiple courses of treatment can further improve neurological function and delay illness progression in most patients.

Umbilical cord mesenchymal stem cells;Multiple system atrophy;Intrathecal injection

Q813

A

1673－0364（2014）06－0314－04

2014年9月2日；

2014年9月25日）

10.3969/j.issn.1673-0364.2014.06.004

首都发展基金项目（2007-2033）；国家高新技术研究发展计划（863项目，2007AA022454）；国家重大新药创制基金（20092x09503-019）；军队临床高新技术重大项目（2010gxjs049）。

100142北京市空军总医院血液科（刘静，韩冬梅，丁丽，薛梅，王志东，阎洪敏，朱玲，郑晓丽，董磊，王恒湘）；100850北京市北京放射与辐射医学研究所（郭子宽）。

王恒湘（E-mail：wanghengxiang123@aliyun.com）。