紫外线对白念珠菌的影响

张蕾 杨维玲

(中国人民解放军第二炮兵总医院皮肤科，北京 100088)

白念珠菌是条件致病真菌的主要种群，是医院内获得性感染主要的病原体之一，在通常情况下以共生菌的形式存在于人体内，当机体的抵抗力降低时发生局部或系统性感染，在免疫缺陷的人群中，感染的发生率更高。紫外线是一种低能量的电磁辐射，对生物体具有杀菌和诱变双重生物学效应。自然界中，波长小于280 nm的短波紫外线(UVC)基本被大气吸收，对生物体造成伤害的多为长波紫外线(UVA)和中波紫外线 (UVB)，尤其是UVB占紫外线照射量的80%～90%。本文就近年来关于紫外线对白念珠菌的影响综述如下。

1 紫外线对白念珠菌生长形态的影响

重复照射低剂量窄谱中波紫外线对白念珠菌的影响:随机测试白念珠菌菌株，每天照射UVB 3次共7 d，波长在310～315 nm之间，剂量由0.001 8～0.432 0 J/cm2，7 d后显微镜下观察发现菌丝形成减少，孢子形成增多，并没有发现向光性，因此白念珠菌定植的人类皮肤被UVB照射后不会使得白念珠菌侵袭性生长［1］。

短波紫外线对白念珠菌的影响:菌悬液经紫外线照射(15 W紫外线灯，波长254 nm，总能量输出31 J/m2)5 s后培养，菌落形态光滑的 (O)白念珠菌可转变成三个不同的表型即环型 (R)、皱缩型(W)和星型(S)。测定其蛋白酶产量W＞R＞O＞S;细胞表面疏水性表达O＞R＞W＞S，磷脂酶活性O＞R，W和S型产生很少的磷脂酶［2-3］。

2 紫外线对白念珠菌DNA的氧化损伤作用

微生物蛋白析出实验和碘化丙啶摄取实验表明，脉冲紫外线照射后的白念珠菌细胞膜通透性显著增加。这个结论与测定经过脉冲紫外线作用后的白念珠菌细胞膜上脂质氢过氧化反应增加的水平的密切相关。脉冲紫外线照射后的白念珠菌细胞具有生成细胞活性氧的特定模式，在低剂量脉冲紫外线照射后细胞活性氧最初定位在线粒体，增强的脉冲下细胞活性氧在胞浆中广泛存在。使用特定的线粒体过氧化染色二氢罗丹明123和细胞质的氧化染色二氯荧光乙酰乙酸盐可以测定细胞活性氧水平。使用超氧化物阴离子荧光探针染色也发现由于脉冲的增强细胞内超氧化物水平增高。在脉冲紫外线照射的初始阶段可以观察到白念珠菌细胞内活性氧爆发与细胞凋亡的发生是一致的，这可通过检测细胞凋亡的特定标记、染色质的异常浓缩和细胞膜脂质磷脂酰的外化作用来证实。紫外线辐射剂量的增加也可导致白念珠菌细胞晚期凋亡和坏死表型的发生，这同活性氧从线粒体到胞浆定位的转变和不可逆的细胞膜破裂是一致的。利用单细胞凝胶电泳分析法还发现在相似脉冲紫外线作用下同样的样本有明显的核损伤。虽然亚致死剂量脉冲紫外线 (0.55 μJ/cm2)照射后，可以看到白念珠菌菌株一定程度的细胞修复，但在递增的脉冲剂量下白念珠菌菌株不能进行细胞修复。研究还表明，脉冲紫外线辐射可通过多靶点程序使白念珠菌失活，且在≤0.55 μJ/cm2下没有发现白念珠菌的生长［4］。

同源重组在白念珠菌受到紫外线损伤后的修复中起很大作用。当同源重组分子存在时，白念珠菌RAD 51参与紫外线损伤的转录偶联修复。虽然rad 51、rad 52缺陷株相对于各自的亲代株来说对紫外线更敏感，但rad 51缺陷株和rad 52缺陷株相比较，前者比后者相对更敏感些，更易受紫外线伤害。RAD 51、RAD 52对紫外线敏感性的差异表明依赖重组蛋白修复优先利用Rad51通路。单倍剂量不足是指一个等位基因突变后，另一个等位基因能正常表达，但这只有正常水平50%的蛋白质，不足以维持细胞正常的生理功能。当紫外线辐射强度增加时，单倍剂量不足的RAD 51、RAD 52白念珠菌株对紫外线的敏感性更加明显，说明在RAD 51、RAD 52中重组蛋白量是紫外线损伤修复的限制因素［5］。

核苷酸切除修复(NER)途径是去除像紫外线所致胸腺嘧啶共价结合等DNA改变的主要修复途径，白念珠菌NER突变体对紫外线导致的DNA损伤极其敏感，说明白念珠菌依赖核苷酸途径，这种异常与念珠菌生长的环境有关，白念珠菌常寄居在人类或其他恒温动物黏膜表面，所以不太经常暴露在强烈紫外线下，而酿酒酵母经常暴露在高强度的紫外线下，有可能产生紫外线损伤修复的备用途径。酿酒酵母抗紫外线损伤的一个途径就是光裂合酶，这在白念珠菌中是没有的［6-7］。

人工合成的杂合性菌株经紫外线辐射和诱变处理后可导致杂合性丢失，即杂合的等位基因变成纯合状态的现象。与稳定期相比，紫外线在白念珠菌对数生长期更容易导致杂合性丢失，这表明紫外线在白念珠菌生长迅速时更能诱导纯和状态。另有研究表明日光模拟紫外线波段 (UVA+UVB;295～400 nm)还能够抑制白念珠菌的免疫记忆及迟发型超敏反应。紫外线对白念珠菌的基因及分子水平都有一定影响［8-9］。

白念珠菌RFX2表达一种蛋白，这种蛋白和人感染白念珠菌后产生的抗体相互作用。RAD 6和DDR 48为DNA损伤感应基因，白念珠菌RFX2可直接或间接的抑制损伤感应基因的表达，损伤感应基因不能启动保护机制使白念珠菌RFX2易受紫外线损伤，相反，白念珠菌RFX2突变株能耐紫外线损伤。白念珠菌中氮脒衍生物处于惰性，经紫外线照射后也变得非常活跃，表现出强大的抑菌活性［10-11］。

色氨酸作为糠秕马拉色菌中的主要氮源，能诱导强有力的紫外线吸收生物碱pityriacitrin(PIT)的产生。体外研究对含有PIT和不含有PIT的白念珠菌照射UVB(1 J/m2)，发现照射后不含有PIT的白念珠菌死亡，而含有PIT的白念珠菌生长不受限，因此证明PIT在白念珠菌中有紫外线保护作用［12］。

3 紫外线应用于临床杀菌方面的研究

用短波紫外线装置照射被微生物污染过的软聚合物导管，这些微生物包括白念珠菌、金黄色葡萄球菌、大肠杆菌和绿脓杆菌。在持续3 h的污染后给予模拟无菌处理，结果显示UVC杀菌与剂量和时间有关。照射2 min能灭活金黄色葡萄球菌、大肠杆菌和绿脓杆菌，而杀灭白念珠菌则需要照射20 min以上的短波紫外线［13］。另外，用日光消毒法灭活由饮用水传播的微生物的评估发现，经过8 h日光模拟照射 (300～400 nmUV，200 W/m2)，白念珠菌的生存能力至少下降4个对数单位 (缩小104)［14］。另有研究表明使用银液和紫外线灯照射(UVA，395 nm)能加强微生物尤其是真核微生物(以白念珠菌为代表)被灭活效率。这因为氧化银可被紫外线激活，并与水分子发生反应生成羟自由基，羟自由基损伤真核生物细胞壁并使其内的线粒体酶失活而导致死亡。因此由银和光辐射产生的微生物钝化作用有望用于家电杀菌［15］。

近年来有研究报道通过制作慢性非致死性白念珠菌感染的三度烧伤小鼠模型，使念珠菌株稳定转化成含有Gaussia荧光素酶基因形式，这种形式可通过实时生物发光成像来观察白念珠菌感染的情况。研究发现感染后30 min(0 d)用2.92 J/cm2UVC照射，平均99.2%的白念珠菌失去冷光;感染后24 h(1 d)用6.48 J/cm2UVC照射，可使白念珠菌冷光降低95.8%。上述数据表明在感染当天用UVC治疗可明显减少烧伤后真菌微生物感染，研究进一步证实6.48 J/cm2的UVC作用于正常小鼠皮肤，24 h内没有发现显著的损害，但通过免疫荧光可发现正常小鼠皮肤受到6.48 J/cm2UVC照射后能很快出现DNA损伤(环丁烷嘧啶二聚体)，这种损伤在UVC照射后的24 h内可彻底修复，即对皮肤产生的损伤可自动修复，因此可以用UVC治疗烧伤后真菌微生物感染［16］。

UVA是一种仅在其直接照射区发挥作用的光波，在眼部可能造成直接光损伤，或者诱导自由基产生间接光化学损伤。核黄素是一种可微溶于水，无毒黄色固体状维生素B衍生物，在人眼角膜基质内穿透力极佳，临床发现利用核黄素滴眼，紫外线照射可明显抑制白念珠菌生长［17］。同时，组织调节剂已在临床常规使用，以增加义齿固定部位的密合性，然而，随着时间的推移这种材料会变质并且容易被微生物侵袭，研究设计将含有光敏剂的组织调节剂粉末做成液体试样，浓度分别为0、10、15和20 wt%(重量百分比)，试样接种白念珠菌后予紫外线 (0、2、4 h)照射，照射后，白念珠菌的菌落形成单位明显下降，且随着光敏剂的混合比和照射时间增加，抗菌效果相应提高。紫外线能杀死一些常见微生物，其对紫外线的抵制顺序依次为:MS-2噬菌体＞枯草芽孢杆菌＞大肠杆菌＞金黄色葡萄球菌和白念珠菌［18］。

以上将紫外线对白念珠菌生长形态、DNA氧化损伤作用及应用于临床杀菌方面的研究进行了大致阐述。紫外线对白念珠菌影响的阐述最终将有助于了解光控发育机制和环境因素是如何在调节白念珠菌的生长发育中起作用的。白念珠菌光信号转导途径是随着生长发育过程中多个基因的表达及其相互作用完成的，同时白念珠菌是否通过其紫外线受体来调控孢子和菌丝阶段一些基因的表达促进其生长，紫外线照射后白念珠菌的超微结构如细胞壁和胞质内结构有无改变，以及重复低剂量非致死量照射后再予常规培养白念珠菌是否对其抵抗能力增强都有待进一步研究，近年来，随着广谱抗生素、糖皮质激素、免疫抑制剂的广泛使用，以及器官移植、导管技术的开展，白念珠菌感染也不断增加，当前工作可致力于动物实验及临床实验等问题，为以后的实际应用打下基础。

［1］Brasch J，Kay C.Effects of repeated low-dose UVB irradiation on the hyphal growth ofCandida albicans［J］.Mycoses，2006 ，49(1):1-5.

［2］Antony G，Saralaya V，Bhat GK，et al.Phenotypic switching and its influence on expression of virulence factors byCandida albicanscausing candidiasis in human immunodeficiency virusinfected patients［J］.Indian J Med Microbiol，2007，25(3):241-244.

［3］Antony G，Saralaya V，Gopalkrishna Bhat K，et al.Effect of phenotypic switching on expression of virulence factors byCandida albicanscausing candidiasis in diabetic patients［J］.Rev Iberoam Micol，2009 ，26(3):202-205.

［4］Farrell H，Hayes J，Laffey J，et al.Studies on the relationship between pulsed UV light irradiation and the simultaneous occurrence of molecular and cellular damage in clinically-relevantCandida albicans［J］.J Microbiol Methods，2011，84(2):317-326.

［5］García-Prieto F，Gómez-Raja J，Andaluz E，et al.Role of the homologous recombination genes RAD51 and RAD59 in the resistance ofCandida albicansto UV light，radiomimetic and antitumor compounds and oxidizing agents［J］.Fungal Genet Biol，2010 ，47(5):433-445.

［6］Legrand M，Chan CL，Jauert PA，et al.Analysis of base excision and nucleotide excision repair inCandida albicans［J］.Microbiology，2008，154(Pt 8):2446-2456.

［7］Legrand M，Chan CL，Jauert PA，et al.Role of DNA mismatch repair and double-strand break repair in genome stability and antifungal drug resistance inCandida albicans［J］.Eukaryot Cell，2007，6(12):2194-2205.

［8］Takagi Y，Akada R，Kumagai H，et al.Loss of heterozygosity is induced inCandida albicansby ultraviolet irradiation［J］.Appl Microbiol Biotechnol，2008，77(5):1073-1082.

［9］Ullrich SE，Kripke ML，Ananthaswamy HN.Mechanisms underlying UV-induced immune suppression:implications for sunscreen design［J］.Exp Dermatol，2002，11(Suppl 1):13-16.

［10］Sánchez MI，Vázquez O，Vázquez ME，et al.Light-controlled DNA binding of bisbenzamidines［J］.Chem Commun(Camb)，2011，47(39):11107-11109.

［11］Hao B，Clancy CJ，Cheng S，et al.Candida albicansRFX2 encodes a DNA binding protein involved in DNA damage responses，morphogenesis，and virulence［J］.Eukaryot Cell，2009 ，8(4):627-639.

［12］Machowinski A，Krmer HJ，Hort W，et al.Pityriacitrin--a potent UV filter produced byMalassezia furfurand its effect on human skin microflora［J］.Mycoses，2006，49(5):388-392.

［13］Bak J，Begovic T，Bjarnsholt T，et al.A UVC device for intraluminal disinfection of catheters:in vitrotests on soft polymer tubes contaminated with Pseudomonas aeruginosa，Staphylococcus aureus，Escherichia coliandCandida albicans［J］.Photochem Photobiol，2011 ，87(5):1123-1128.

［14］Lonnen J，Kilvington S，Kehoe SC，et al.Solar and photocatalytic disinfection of protozoan，fungal and bacterial microbes in drinking water［J］.Water Res，2005，39(5):877-883.

［15］He J，Moriya Y，Oketa T，et al.Inactivation mechanism of microorganisms by the synergy of silver and light irradiation，and the application in household electrical appliances［J］.Sheng Wu Gong Cheng Xue Bao，2008，24(6):1091-1097.

［16］Dai T，Kharkwal GB，Zhao J，et al.Ultraviolet-C light for treatment ofCandida albicansburn infection in mice［J］.Photochem Photobiol，2011，87(2):342-349.

［17］Sauer A，Letscher-Bru V，Speeg-Schatz C，et al.In vitroefficacy of antifungal treatment using riboflavin/UV-A(365 nm)combination and amphotericin B［J］.Invest Ophthalmol Vis Sci，2010，51(8):3950-3953.

［18］Liu WJ，Zhang YJ.Effects of UV intensity and water turbidity on microbial indicator inactivation［J］.J Environ Sci(China)，2006，18(4):650-653.