真菌多样性研究方法进展

石莉娜 刘晓峰

(1.云南昆明长水国际机场医疗急救中心，昆明 650500;2.昆明理工大学 生命科学与技术学院，昆明 650500)

自然界中的微生物分布广、种类多、资源极其丰富，主要包括细菌、病毒、真菌等。迄今人们已发现的微生物物种仅为自然界中微生物总数的1%～10%［1］。微生物群落多样性是环境微生物多样性研究的核心内容。目前微生物多样性研究多局限于细菌，而对真菌的研究相对较少。研究真菌群落多样性可以了解真菌群落结构、真菌的种类和数量分布特点，并且可以进一步为控制和优化真菌群落结构提供参考，同时也是研究微生物群落多样性的重要内容。真菌遍布于自然界，据估计约有数百万种，已发现的仅9万余种，已发现的导致人类疾病的仅约400种［2］。人类也生活在真菌包围的环境中，日常工作、生活中所接触到的真菌种类远超目前的认知。因此，不论是自然环境还是人体都具有较高的真菌多样性。

真菌多样性的研究方法很多，从国内外目前采用的方法来看，大致上可分为:传统的微生物培养法、分子生物学方法以及宏基因组学技术。随着现代科学技术的发展，越来越多的新技术、新方法用于真菌多样性领域的研究，使人们对真菌多样性的认识更加全面深入。

1 传统微生物培养法

从传统上讲，真菌多样性的研究主要利用分离培养及形态学检测的方法，该技术在实验室被广泛使用。尽管各种新的培养技术不断出现，但此方法费时费力，敏感度和特异性也较低，也不能反应全部的真菌群落信息［3-4］。Amann 等［5］曾根据微生物原位的、不依赖于培养的微生物系统发育学研究结果认为:在自然界中，通过实验室人工培养方法已经被分离和描述的微生物物种数量仅占估计数量的1% ～5%，而其余大多数微生物种群还仍然未被分离和认识，因此，人们不能利用传统的微生物培养技术获得真菌多样性的全部信息，极大的限制了研究的广泛性。在临床致病菌的鉴定方面，培养的方法更为常用。Rasi等［6］利用培养法对从伊朗花斑糠疹患者皮肤上分离得到的马拉色酵母菌进行鉴定过程中，发现球形马拉色菌是最常分离到的菌种，大约占31.3%，其次是糠秕马拉色菌(20.5%)等。Findley等［7］通过微生物培养法从10个健康成人的14个部位的皮肤分离真菌，经鉴定11个刚体部位和胳膊表面的优势真菌是马拉色菌属，通过比较，脚底、脚趾甲和趾间具有较高的真菌多样性。

2 分子生物学方法

鉴于分离培养技术的局限性，近年来，利用不依赖培养的方法分析和鉴定微生物群落多样性的实验越来越普遍。自从Pace［8］提出将分子生物学方法用于微生物多样性研究，微生物分子生态学得到了长足的发展。分子生物学技术应用于微生物群落结构分析使得对环境样品中占大部分的不可培养微生物的研究成为了可能。目前，大多数用于分析微生物群落结构的方法是基于PCR扩增的。在分析微生物群落结构多样性时，rRNA是目前应用最广泛的分子标记，它具有在功能上高度保守，其序列上的不同位置具有不同的变异速率，存在于所有的有机体(病毒除外)内等优点。对于细菌而言，16S rRNA分析在实际应用中最为广泛，与细菌相比，使用真菌18S rDNA只能鉴定到属或科的水平。真菌的非编码rRNA区域，如ITS区域 (Internal transcribed spacer)，进化快速，序列上的变化更加广泛，因此提供了更多的分类信息，弥补了18S rRNA的局限性。虽然如此，在实际研究内容中仍然要根据对分类等级的不同要求来选择合适的分子标记。

分子生物学方法的应用使在遗传水平上研究微生物多样性成为了可能，该方法可归纳为三方面:①基于PCR技术的研究方法，这些方法是对样品直接提取DNA或者RNA，然后对特定基因设计引物进行PCR扩增，再利用不同的方法进行分析，如变性梯度凝胶电泳(Denaturing gradient gel electrophoresis，DGGE)、构建克隆文库、末端限制性长度多态性(Terminal restriction fragment length polymorphism，T-RFLP)等。②基于分子杂交技术的分子标记法，如荧光原位杂交 (Fluorescence in situ hybridization，FISH)，可以对微生物在特定环境中的存在与否、分布模式及丰度等情况进行研究，具有较高的灵敏性和特异性。③基于DNA序列测定的研究方法，分析具体碱基序列的分布情况，通过与生物信息学结合，进行数据比较分析，如元基因组(Metagenome)测序技术，成为研究难培养微生物或不可培养微生物多样性的重要方法［9］。

2.1 基于PCR的克隆文库方法

基于PCR的克隆文库方法使对不可培养微生物的分析成为可能，Pace［10］提出将PCR产物进行克隆后测序，大大提高了对微生物群落结构的认识，是使用较为广泛的一种方法。目前已有研究采用针对18S rDNA及ITS的克隆文库构建技术对肠道内真菌群落的多样性进行分析，研究结果表明人肠道真菌多样性比较低，主要以不同亚型的芽囊原虫属为主［11］。

2.2 变性梯度凝胶电泳 (DGGE)

DGGE最初是lerman等［12-13］发明的，起初主要用来检测DNA片段中的点突变。1993年，Muyzer等［14］首次将其用于微生物群落多样性的研究。DGGE普遍用于分析环境中细菌、真菌、病毒群落的生物多样性。Kim等［15］利用PCR-DGGE技术分析了日本和中国发酵豆瓣酱中的细菌和真菌群落多样性，确定了米曲霉和鲁氏酵母的存在。Weerasekera等［16］通过PCR-DGGE方法研究人唾液中的酵母菌，在其中六个样品中鉴定出两种酵母菌，分别是白色念珠菌和杜氏假丝酵母，有力的证明利用DGGE技术研究口腔中的酵母菌是一种相对快速便捷的方法。

2.3 末端限制性长度多态性 (T-RFLP)

T-RFLP技术是在末端限制性片段长度多态性(Restriction fragment length polymorphism，RFLP)技术基础上发展起来的，依据rDNA序列的保守性和特异性，选择具有系统进化标记特征的序列作为目的序列。T-RFLP技术灵敏度高，对于评估复杂环境样品的多样性和快速的比较不同生态系统的微生物群落结构和多样性是一种有力的工具。Curlevski等［17］使用T-RFLP方法研究了澳大利亚商业化混交林和单一种植南洋杉林场土壤真菌群落的不同，通过对真菌的ITS区域进行分析表明子囊菌门的丰度最高，其次是担子菌门和接合菌门，但在不同类型的林场中它们的相对丰度存在差异。

2.4 实时荧光定量PCR(qPCR)

qPCR技术于1996年由美国Applied Biosystems公司推出，是将荧光能量传递技术 (Fluorescence resonance energy transfer，FRET)应用于 PCR，实现了PCR从定性到定量的飞跃。qPCR技术目前已得到广泛应用。李晓然等［18-19］在对汾酒发酵过程和汾酒酒曲制作过程中细菌和真菌多样性的研究中，利用qPCR技术对整个过程中的细菌和真菌进行了定量，发现在汾酒发酵过程中真菌的数量保持相对稳定，在酒曲制作过程中真菌的数量整体上呈下降趋势。Li等［20］通过qPCR方法研究了老年人舌背的真菌多样性，表明老年人口腔中的真菌多样性极高，并不仅限于念珠菌属，其多样性与老年人的健康状态也具有密切的关系。

2.5 荧光原位杂交 (FISH)

比起费时费力且难以展现全部微生物群落信息的依赖于培养的方法和难以实现定量分析的多种依赖于PCR扩增的分子生物学方法，使用探针杂交来研究微生物群落多样性是一种更为快速的方法。荧光原位杂交是以荧光标记的寡核苷酸探针来探测生态系统中微生物细胞的一种技术，不仅能研究自然或人工环境中的微生物个体，并且可以对微生物群落进行评估。Lepère等［21］使用酪胺信号放大技术与FISH结合的方法，用18S rDNA特异性的引物分析了湖水中的真核超微浮游生物的主要类群，获得了真核浮游微生物的定量结果。

虽然分子生物学方法目前是阐述微生物多样性的强有力技术手段，并且在真菌多样性研究中具有传统培养法无法比拟的优势，但是基于PCR扩增的各种方法及FISH等方法仍然存在着多种弊端，例如引物的偏向性、PCR存在的其他系统偏差以及FISH方法中由于引物的不匹配造成对分析结果的错误估计等。在实际的研究中，通常将多种技术综合使用，以避免由于方法原理本身所带来的不可避免的偏差，可提供更加全面准确的微生物多样性变化的信息［22-24］。

2.6 序列标签标记的高通量测序

随着测序技术的发展，被称为“第二代测序(next-generation sequencing［NGS］)”技术在过去几年中不断涌现。其特点是:高通量，低成本，可以同时对多个单独的DNA分子进行测序，这一改进比起每条序列需要单独分析的Sanger法具有巨大的优势。第二代测序技术主要包括罗氏454公司的GS-FLX测序平台、Illumina公司的Solexa Genome Analyzer测序平台和 ABI公司的 Solid测序平台［25］。自从 Hamady 等［26］建立了在不同的样品PCR引物上分别添加序列标签 (barcode)来作为高通量测序后根据序列区分不同样品的标记，高通量测序技术越来越广泛地应用到微生物群落多样性的分析中。综合比较二代测序平台，在研究微生物多样性方面应用较广泛的是焦磷酸测序 (Pyrosequencing)。李晓然等［18］利用真菌 ITS1的焦磷酸测序，研究了中国传统汾酒发酵过程中的真菌群落多样性，分析了在汾酒发酵过程中真菌的变化以及主要存在的真菌菌种，其中有60%的ITS序列属于酵母菌科，丰度最高的是东方伊萨酵母，其次为啤酒酵母。Delhaes等［27］利用焦磷酸测序的方法对囊泡纤维症患者的真菌多样性进行了研究，结果表明肺功能下降及临床状态不好的患者真菌多样性明显降低。Hoffmann等［28］对人体肠道的真菌多样性进行研究，通过焦磷酸测序表明人肠道中的真菌共66个属，丰度较高的是子囊菌纲和担子菌类。

3 宏基因组学技术(Metagenomics)

利用基于rDNA的分子生物学方法研究微生物多样性，对于庞大的微生物世界仍然是不足够的，远不能阐明微生物的生理生化代谢特征。1998年，Handelman等［29］首次提出宏基因组的概念，并第1次使用了Metagenomics这个词。宏基因组学技术是通过提取某一环境样品所有微生物的基因组DNA，或通过鸟枪法直接测序探究环境中微生物的群落结构和功能，或构建宏基因组文库及对文库进行筛选寻找和发现新的功能基因及活性代谢产物。通过这两方面的研究，极大地丰富了我们对环境样品微生物多样性和其功能的认知。

宏基因组学技术避开传统的微生物分离培养方法，直接从样品中提取总DNA来展开研究，理论上覆盖了环境样品中的全部微生物，在分析环境微生物复杂群落结构领域得到广泛应用。该技术在微生物多样性领域的研究，有关细菌方面［30-31］的居多，而关于真菌群落多样性的研究为数并不多。Illeghems等［32］利用宏基因组学技术研究了可可豆自然发酵过程中的真菌和细菌群落多样性，研究结果表明，葡萄汁有孢汉逊酵母、仙人掌有孢汉逊酵母、啤酒酵母、发酵乳杆菌和巴氏醋杆菌是主要存在的菌种，并且确定了主要以乳杆菌为宿主的肌病毒科和长尾噬菌体的存在。这是第1篇利用宏基因组学技术并结合454焦磷酸测序研究自然发酵可可豆中群落多样性种系发生分析的报道，显示了宏基因组学技术相比于之前研究方法的优越性，能够获得更加全面的微生物群落信息。宏基因组学技术不仅在研究微生物群落结构方面蕴含巨大潜力，在发现新功能基因及活性物质方面也具有极大的优势。Cardoso等［33］在对被蜗牛侵袭的农作物进行宏基因组学分析中，第1次对其微生物群落和参与生物化学通路的主要基因进行了研究，发现变形菌门是主要的细菌门，其次是拟杆菌门和硬壁菌门，而病毒、真菌及古细菌的多样性稍低。另外，通过功能分析发现其中存在的大量微生物基因有助于宿主降解木质纤维素、对异生物质脱毒以及合成必需氨基酸和维生素，同时有利于蜗牛的适应性和广泛摄食，并且检测到2 700多种编码糖苷水解酶区域和碳水化合物结合结构域的基因。通过宏基因组学技术不仅能够避免PCR扩增带来的偏差，全面而准确的研究微生物群落多样性，同时也为研究样品中微生物生化代谢、发现新功能基因和活性物质提供了极大的便利。

宏基因组学技术在分析群落多样性中不可避免地也会存在一些弊端，例如测序产生的大量数据为后续的序列分析和处理带来了挑战，同时对计算机以及数据库的要求也在不断提高。尽管如此，宏基因组学技术本身所具有的巨大优势是目前其他研究方法不可比拟的。近年来，宏基因组学技术已经开始影响真菌生物学，逐渐成为研究真菌多样性的一个新的发展方向和研究热点，也增加了获得新生物活性物质的机会，显示宏基因组学技术在此方面蕴含的巨大发展潜力。

4 前景与展望

近年来，随着各种新技术的不断完善与发展，对真菌多样性的研究逐渐深入，利用这些新技术可以从不同的角度来研究真菌多样性，为环境微生物多样性和人体真菌病的诊断治疗奠定坚实的基础。值得一提的是，为了获得更为全面的真菌多样性信息，在条件许可的情况下可将几种方法结合起来使用。目前对于真菌多样性的研究是多方面的，不论是环境中、食品中还是定植于人体各部位的真菌，通过对其多样性的研究必能为指导实践提供理论基础。因此，真菌多样性研究方法的不断完善必将推动真菌多样性研究的快速发展。

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