MicroRNAs在阿尔茨海默病发病中的作用

牛静亚 张 睿 许顺江

(河北医科大学第一医院中心实验室，河北 石家庄 050031)

目前，全世界有2 000多万阿尔茨海默病(AD)患者，尚无特效治疗或逆转病情的药物。AD的病因极其复杂，一般认为与遗传、环境及二者相互作用有关，并且发病机制还不十分明确。MicroRNA是一种长度为20～24个核苷酸的5′端带磷酸基团、3′端带羟基的内源性非编码小RNA，在生物体内具有重要作用。miRNAs不仅参与生理过程的调控，在疾病的发生以及机体对药物的反应等生命过程中也发挥重要调节作用，可通过多种途径影响疾病的发生、发展与转归。利用生物信息学的方法估计生物体内约有三分之一编码蛋白的基因受miRNAs的调控〔1〕。目前已经发现的人类miRNAs超过1 400个(miRBase Release 17)，它们在生物体内既是代谢产物，也是机体有目的编码的重要调控分子。因此，miRNAs调控紊乱可能是人体多种疾病发生的潜在因素。越来越多的证据表明，miRNAs可能参与了AD的发生发展过程，本文概述miRNAs在AD发病中的研究进展及前景。

1 miRNAs的生物合成及其在神经系统中的功能

miRNAs对器官发育和细胞稳态十分重要，主要包括外显子miRNAs和内含子miRNAs。外显子miRNAs，例如let-7和lin-4，首先由细胞核内编码miRNAs的基因转录成pri-microRNAs，然后被Drosha酶剪切成长约70 bp的发夹状pre-miRNAs，接着被转运蛋白(Exportin-5)从核内转运至胞质中，Dicer酶将其剪切成长约22 bp的成熟miRNAs:miRNAs*，其中miRNAs链被RNAase降解，另一条链与Argonaute蛋白紧密结合，形成非对称的RNA诱导沉默复合物(RISC)复合物(RNA-induced silencing complex)，该复合物中的miRNAs以特异或非特异的方式与其靶mRNA的3′-非翻译区(UTR)结合，从而引起靶基因的降解或翻译抑制。与外显子miRNAs不同，内含子miRNAs在mRNA的内含子加工过程中产生，但二者的作用方式相同。miRNAs几乎调控机体的每一个生理过程，并且调控网络极其复杂。一种miRNAs可调控上百种靶基因的表达。反之，一种mRNA也可同时接受若干种miRNAs的协同调节。

miRNAs广泛存在真核生物中，尤其在哺乳动物及啮齿类动物脑中含量相当丰富，在进化上具有高度保守性、时序性和组织特异性。miRNAs参与了神经元的生长、分化等多个生理过程。例如，miR-134在海马神经元的突触中表达，通过抑制单丝氨酸蛋白激酶1(LIMK1)的翻译调控突触可塑性〔2〕。miR-30a-5p在人类额前皮质椎体神经元中表达丰富，可负性调控脑源性神经营养因子(BDNF)的表达〔3〕。Abdelmohsen等〔4〕发现miR-375通过负性调控RNA结合蛋白HuD的表达影响神经元的分化。由于miRNAs参与了脑细胞的分化、发育、凋亡等各种生理过程，大脑中任何miRNAs的异常表达都可能影响神经元的存活和它对神经退行性变的抵抗作用，而通过调控这些异常表达miRNAs则可能达到治疗疾病的目的。

2 miRNAs在AD发生中的调控作用

AD是一种进行性发展的致死性神经退行性疾病，病变最易累及与高级认知功能有关的脑区，特别是新皮质和海马，临床表现为认知和记忆功能进行性恶化，日常生活能力不断减退，常伴有各种神经精神症状和行为障碍。目前主要是通过胆碱酶抑制剂、精神类药物结合家庭护理和理疗进行治疗，但并不能抑制疾病的进一步发展。目前，有大量研究表明miRNAs参与了AD的发病过程并有可能起着关键作用。Bilen等〔5〕在整体水平采用突变果蝇dicer1基因的手段和离体水平siRNA干扰HeLa细胞中dicer1蛋白表达的方法抑制miRNAs成熟，结果发现病理性Tau蛋白或多聚谷氨酰胺(polyQ)诱导的神经退行性损害加重，说明miRNAs在神经退行性疾病中发挥了重要调节作用，但miRNAs的具体调节机制还不甚明了。

2.1AD病变的共同病理特征 AD的神经病理改变主要是脑皮质弥漫性萎缩、沟回增宽、脑室扩大，组织病理改变主要是皮质神经元数量减少、神经纤维缠结(NFT)、含有β-淀粉样肽(Aβ)的老年斑(SP)的出现、相关脑区(基底前脑、海马和新皮层等)内神经突触和锥体神经元消失、脑血管淀粉样改变等。NFT的发生主要由于Tau蛋白的磷酸化，SP的淀粉样沉积物主要成分是Aβ，而Aβ是由淀粉样前体蛋白(APP)经β分泌酶(BACE)1/γ-分泌酶分解而来，诸多学者认为Aβ在AD的发病机制中起着十分重要的作用。

2.2miRNAs对AD主要致病基因的调控 APP蛋白在细胞内以跨膜受体的结构形式存在，包括一条较长的细胞外N末端和一条较短的细胞内C末端。APP蛋白可能对神经元的可塑性、神经元的生长和神经突外生有重要作用。APP蛋白有三个主要亚型，分别由APP基因外显子7、8和15的选择性剪切产生。正常神经元的APP基因仅包括外显子15，而缺乏外显子7和8，但在AD患者大脑中发现由APP基因外显子7和8编码的蛋白增多。Smith 等〔6〕最近研究证明，正常人脑中miR-124通过抑制PTBP1的表达，促进APP基因外显子7和8的选择性剪切。而AD病人脑中miR-124的表达明显减少，致使APP基因外显子7和8的选择性剪切减少，神经元中APP蛋白亚型大量增多。最近Liu等〔7〕发现，SAMP8鼠的大脑中APP蛋白表达量明显增多，但其mRNA却没有明显变化，提示存在APP的转录后调控。他们利用miRanda软件进行分析，发现APP mRNA的3′-UTR存在miR-16的结合位点，并进一步验证了miR-16对SAM鼠内源性APP的负性调控作用。Vilardo等〔8〕通过定位诱变研究发现，APP基因的3′-UTR存在miR-101的识别位点，miR-101表达的减少可导致APP蛋白的表达增多，从而影响Aβ的沉积。APP mRNA的3′-UTR不仅存在miR-101的直接作用靶点还存在miR-106a，miR-520c〔9〕和miR-20家族〔10〕的直接作用靶点。综上，作为转录后调节因子，miRNAs在AD的发生发展过程中起着重要的调控作用，特定miRNAs异常表达可能影响APP基因或蛋白的表达，从而促进AD的发生或恶化。但是，某一靶基因的表达又受多个miRNAs的调控，疾病发生过程中各种miRNAs之间又存在着怎样一种制约与协同关系还有待进一步研究。

Aβ是由39～43个氨基酸残基组成的蛋白质，为APP经BACE1/β分泌酶水解产物，是构成SP核心和血管壁沉积物的主要成分。Aβ的逐渐积累是AD发生的主要原因，而Aβ的异常沉积除了与APP表达增多关系密切外，还与BACE1的异常表达密不可分。Wang等〔11〕通过对不同阶段的AD患者大脑中异常表达的miRNAs研究发现，miR-107在AD发病早期表达即明显下降，并且miR-107可能通过负性调控BCAE1蛋白的表达影响AD的病理进程。同时，Hébert等〔12〕在散发的AD患者脑中观察到，miR-29a/b和BCAE1蛋白的表达呈现明显的负相关，且BCAE1 mRNA的3′-UTR存在miR-29a/b的结合位点，在APP mRNA的3′-UTR存在let-7、miR-15a、miR-101和miR-106b的结合位点，而所有这些miRNAs在AD病人的脑中表达量均下降。此外，他们还在细胞水平验证了miR-29a/b对内源性BCAE1蛋白的负性调控作用。Boissonneault等〔13〕研究发现miR-298和miR-328可负性调控BACE1蛋白的表达，但其在老龄化的APPswe/PS1转基因小鼠海马表达量却明显降低。综上，多个miRNAs均可负性调控BCAE1蛋白的表达，特定的miRNAs表达异常均有可能导致BCAE1蛋白表达增多，从而促进Aβ的沉积和AD的发生。

微管是神经细胞骨架成分，由微管蛋白及微管相关蛋白组成，参与多种细胞功能。tau基因位于17号染色体长臂，其表达产物是含量最高的微管相关蛋白。正常人脑中Tau蛋白有6种同功异构体，仅含有2～3个磷酸基。而AD患者脑的Tau蛋白过度磷酸化，每分子Tau蛋白可含5～9个磷酸基，并丧失正常生物功能。近年来，有关miRNAs对AD病人脑中Tau蛋白磷酸化的影响也有了进一步的研究。ERK1是Tau蛋白磷酸化过程中的重要调控因子，miR-15家族通过负性调控ERK1的表达影响Tau蛋白磷酸化的过程，但在AD患者的脑中miR-15家族的表达量却明显减少，进一步证明了miRNAs在AD发病过程中的重要调控作用〔14〕。同时，也有研究证明，miR-128参与Bcl-2结合抗凋亡基因(BAG)2/热休克蛋白(HSP)70复合物对不溶性Tau蛋白和磷酸化Tau蛋白的清除〔15〕。综上，多种miRNAs参与了AD的发病过程，但是其调控又具有一定的复杂性，miRNAs能否如患者脑脊液中的Aβ、总Tau蛋白及磷酸化的Tau蛋白等分子一样作为AD早期诊断的分子标志，尚待进一步的研究。

2.3miRNAs对AD其他非特异性致病因子的调控 AD的发病是一个极其复杂的过程，miRNAs除了对特异性致病基因(APP、Aβ、tau)有调控作用外，对其他致病因子也具有重要调控作用。Sethi等〔16〕发现miR-146a受核因子(NF)-κB的直接调控，而miR-146可以通过负性调控补体因子H的表达以对抗大脑的炎症反应进而影响AD进展。Yao等〔17〕通过研究AD模型鼠发现，miR-103和miR-107抑制肌动蛋白结合蛋白cofilin的表达，二者表达水平的降低会导致肌动蛋白结合蛋白cofilin的表达过量，进而影响细胞结构骨架的变化，使神经细胞更易受损。Wang等〔18〕通过对APPswe/PS△E9转基因小鼠的研究发现，转化生长因子(TGF)-β二型受体(TβR Ⅱ) mRNA的3′-UTR存在miR-106b的作用位点，miR-106b可以负性调控TβR Ⅱ的翻译，且通过体外细胞实验印证了这一结果。一定程度上说明了TGF-β信号通路在AD发病过程中起着重要作用。综上，miRNAs的表达异常不仅对AD发病过程中的标志性蛋白的表达有影响，而且会通过影响其他致病因子的表达导致细胞信号通路的改变，而这些改变都有助于AD的发生。

3 存在的问题及展望

目前对于miRNAs在AD发病机制中的作用已取得了一定的进展，但仍存在一定的局限性和挑战：①每种miRNAs可作用于多个靶基因，仅集中与一种靶基因的研究无疑忽视了miRNAs的总体效应及各种靶蛋白的协同作用。②每个靶基因可能受多种miRNAs调控，仅集中于一种miRNAs的影响，可能混淆生物效应的真实性。③动物模型对疾病发病机制的研究具有重要价值，但是由于人体的复杂性其结果并不能直接用于人体。④每一种miRNAs可在多大程度上调控哪些靶蛋白的表达还有待进一步研究。⑤细胞内miRNAs的自身调控及反馈调控及确定调控miRNAs的机制还需深入探讨。

miRNAs的广泛发现及其对脑组织发育、神经细胞分化、突触功能的影响，使人们对神经系统疾病的认识更进一步，筛选与疾病相关的miRNAs及其靶基因和相应的蛋白表达的改变仍将是该领域的研究热点。随着人类对miRNAs研究的不断深入，miRNAs和疾病之间的关系可能更加明了，miRNAs可能成为疾病诊断新的生物学标记，鉴于miRNAs在AD发病机制中的作用还有待于进一步揭示，利用寡核苷酸抑制高表达的miRNAs或miRNAs干扰某些致病基因的过量表达有望成为疾病治疗的新途径。

4 参考文献

1Lewis BP，Burge CB，Bartel DP.Conserved seed pairing，often flanked by adenosines，indicates that thousands of human genes are microRNA target〔J〕.Cell，2005;120(1)：15-20.

2Schratt GM，Tuebing F，Nigh EA,etal.A brain-specific microRNA regulates dendritic spine development〔J〕.Nature，2006;439 (7074)：283-9.

3Mellios N，Huang HS，Grigorenko A,etal.A set of differentially expressed miRNAs，including miR-30a-5p，act as post-transcriptional inhibitors of BDNF in prefrontal cortex〔J〕.Hum Mol Genet，2008;17(19)：3030-42.

4Abdelmohsen K，Hutchison ER，Lee EK,etal.miR-375 inhibits differentiation of neurites by lowering HuD levels〔J〕.Mol Cell Biol，2010；30(17)：4197-210.

5Bilen J，Liu N，Burnett BG,etal.MicroRNA pathways modulate polyglutamine-induced neurodegeneration〔J〕.Mol Cell，2006;24 (1)：157-63.

6Smith P，Al Hashimi A，Girard J,etal.In vivo regulation of amyloid precursor protein neuronal splicing by microRNAs〔J〕.J Neurochem，2011;116(2):240-7.

7Liu W，Liu C，Zhu J,etal.MicroRNA-16 targets amyloid precursor protein to potentially modulate Alzheimer′s-associated pathogenesis in SAMP8 mice〔J〕.Neurobiol Aging，2010;33(3):522-34.

8Vilardo E，Barbato C，Ciotti M,etal.MicroRNA-101 regulates amyloid precursor protein expression in hippocampal neurons〔J〕.J Biol Chem，2010;285(24)：18344-51.

9Patel N，Hoang D，Miller N,etal.MicroRNAs can regulate human APP levels〔J〕.Mol Neurodegener，2008;6：3-10.

10Hébert SS，Horré K，Nicola L,etal.MicroRNA regulation of Alzheimer′s amyloid precursor protein expression〔J〕.Neurobiol Dis，2009;33(3)：422-8.

11Wang WX，Rajeev BW，Stromberg AJ,etal.The expression of microRNA miR-107 decreases early in Alzheimer′s disease and may accelerate disease progression through regulation of beta-site amyloid precursor protein-cleaving enzyme 1〔J〕.J Neurosci，2008;28(5):1213-23.

12Hébert SS，Horré K，Nicolaï L,etal.Loss of microRNA cluster miR-29a/b-1 in sporadic Alzheimer′s disease correlates with increased BACE1/beta-secretase expression〔J〕.Proc Natl Acad Sci U S A,2008;105(17)：6415-20.

13Boissonneault V，Plante I，Rivest S,etal.MicroRNA-298 and microRNA-328 regulate expression of mouse β-amyloid precursor protein-converting enzyme 1〔J〕.J Biol Chem，2009;284(4):1971-81.

14Hébert SS，Papadopoulou AS，Smith P,etal.Genetic ablation of Dicer in adult forebrain neurons results in abnormal tau hyperphosphorylation and neurodegeneration〔J〕.Hum Mol Genet， 2010;19(20)：3959-69.

15Carrettiero DC，Hernandez I，Neveu P,etal.The cochaperone BAG2 sweeps paired helical filament- insoluble tau from the microtubule〔J〕.J Neurosci，2009;29(7):2151-61.

16Sethi P，Lukiw WJ.Micro-RNA abundance and stability in human brain：specific alterations in Alzheimer′s disease temporal lobe neocortex〔J〕.Neurosci Lett，2009;459(2):100-4.

17Yao J，Hennessey T，Flynt A,etal.MicroRNA-related cofilin abnormality in Alzheimer′s disease〔J〕.PLoS One，2010;5(12):e15546.

18Wang H，Liu J，Zong Y,etal.miR-106b aberrantly expressed in a double transgenic mouse model for Alzheimer′s disease targets TGF-β type Ⅱ receptor〔J〕.Brain Res，2010;1357:166-74.