拉曼光谱在乳腺癌相关研究中的应用

王心莉 韩 冰 路 璐 吴 迪 杜 烨 范志民 郑 超 张海鹏

(吉林大学第一医院乳腺外科，吉林 长春 130021)

拉曼光谱分析技术是以拉曼效应为基础建立起来的分子结构表征技术。由于拉曼光谱具有操作简便、测定时间短、灵敏度高、无损伤等优点，使其在医学领域研究中得到广泛应用。最近，由于拉曼光谱仪器的改良和数学方法在结果分析中的应用，使拉曼光谱在肿瘤诊断及发生机制研究方面显示出突出优势，成为新的研究热点。

1 拉曼光谱在乳腺癌中的研究基础

1.1乳腺微钙化的拉曼光谱研究 早期的拉曼光谱应用于乳腺癌诊断，主要针对于钙化灶成分的鉴别。乳腺癌的钙化主要分为两类，以草酸钙为主要成分的钙化；磷酸钙和碳酸钙，以羟磷灰石为主要成分。草酸钙最常见于乳腺良性疾病，较少见于乳腺癌，而磷酸钙主要见于增生性疾病中，包括乳腺良、恶性疾病，但良性疾病形成的钙化除了主要成分羟磷灰石以外含有比恶性钙化更多的碳酸盐，相比之下恶性钙化成分更纯，主要是羟磷灰石，而且恶性病变的钙化往往还有更多的蛋白质。

Haka等〔1〕应用拉曼光谱对含有微钙化灶的人乳腺病灶石蜡切片标本进行研究，检测证实乳腺囊性增生导致的钙化是典型的Ⅰ型钙化，拉曼光谱峰值在912/cm，1 477/cm和1 632/cm；伴有导管癌的Ⅱ型钙化拉曼光谱检测发现并非纯羟磷灰石(960/cm，948/cm，1 028/cm和1 061/cm，1 075/cm)还包含有蛋白质(1 445/cm，1 650/cm)、苯丙氨酸(1 004/cm)和脂质(1 130/cm，1 300/cm)，最为重要的是在960/cm峰增宽表明其中含有碳酸钙。并且，该小组将主成分分析(PCA)与Logistic回归相结合分析以Ⅱ型钙化，结果该方法的敏感性和特异性分别是88%和93%。但是实验采用的是石蜡固定后的组织，而非新鲜组织。固定后标本与新鲜标本不同，这种固定后的标本拉曼光谱检测干扰较多，不利于结果分析。

Saha等〔2〕采用便携式拉曼光谱检测159例新鲜乳腺穿刺活检组织，其中组织中的Ⅰ类钙化即草酸钙的峰值位于912和1 477/cm，Ⅱ类钙化即羟磷灰石的峰值主要位于960/cm；并且在约2 150 μm深处的新鲜乳腺组织中检测到了微钙化。同时根据提供组织形态学信息和化学组成的特征峰的出现与否建立了适合系数(FC)模型，并计算出这个模型对于不同组织的变异系数，其中正常乳腺组织的变异系数为0.03，不伴有微钙化的乳腺病变组织为0.12，伴有微钙化的为0.22。

1.2单个细胞的研究 针对单个细胞的研究所对应的光谱较乳腺组织检测结果相对简单，便于分析，对构成细胞的3个主要成分核酸、蛋白质和脂肪光谱学改变有一定认识。

研究发现乳腺癌细胞DNA的磷酸骨架峰782、810/cm完全消失，1 084/cm的谱线明显减少和脱氧核糖-磷酸振动峰1 155及1 262/cm拉曼谱线也明显减少，表征DNA构象的特征峰812/cm及谱线979 668/cm消失，并有新峰1 175/cm出现，905/cm的谱线增强并有6/cm的红移，可能说明DNA的磷酸根骨架有一定的断裂，导致癌细胞的分裂繁殖失去有效的控制〔3〕。Yu等〔4〕测试了正常细胞和乳腺癌细胞中DNA的拉曼光谱，发现乳腺癌细胞的DNA拟合系数高于正常细胞，而RNA的拟合系数则无明显变化。Zoladek等〔5〕通过共聚焦显微拉曼光谱仪分析了人乳腺癌(MDA-MB-231)细胞在细胞凋亡过程中最初6 h的时间进程光谱图像，结果表明由于DNA缩合在凋亡细胞中DNA拉曼光谱带信号强度增强；将来这种技术可能会成为体外毒理学研究和测试新药物的一种工具。蛋白质在正常乳腺细胞和癌细胞中的拉曼光谱特征还存在争议。有人认为癌细胞与正常细胞在1 658、1 300、1 262、1 002和852/cm的拉曼谱线没有多大区别，可能说明癌细胞中的蛋白质在结构上并没有发生明显的改变。但谢裕安等〔6〕测量人正常上皮乳腺细胞株(HBL-100)和乳腺癌细胞株(MCF-7)的单细胞拉曼光谱时则得出与之不同的结果，该结果表明乳腺癌细胞的谱线强度整体变强，乳腺癌细胞的光谱中蛋白质的归属峰936、1 002和1 445/cm及脂类的归属峰1 298/cm的峰高比正常乳腺细胞的升高。

另外在针对单个细胞的研究中，乳腺癌细胞的特征性受体(Her-2)也有研究报道。Hartsuiker等〔7〕采用共焦显微拉曼光谱成像技术检测化学成分单一的MDA-MB-231，MDA-MB-435s及SK-BR-3乳腺癌细胞系，发现与Her-2表达阳性的SK-BR-3细胞相比，Her-2表达阴性的MDA-MB-231细胞中脂类含量增加而饱和脂肪酸含量降低；同时，在MDA-MB这类具有高度转移性的细胞系中，多不饱和脂肪酸的含量增加。Yang等〔8〕利用p-对巯基苯甲酸介导的抗Her-2抗体共轭银纳米粒子作为表面增强拉曼的探针来检测Her-2阳性乳腺癌SKBR3细胞株及Her-2阴性乳腺癌MCF7细胞株。实验结果显示，SKBR3细胞表现出比MCF7细胞更强大的SERS信号，表明该探针可能会用来区分不同乳腺癌细胞的HER2状态。这种SERS探针制作简单、检测迅速、且具有高SERS敏感性和生物相容性，可以避免传统免疫组织化学和荧光原位杂交两种检测方法费用巨大时间持久的缺点，而且有可能直接检测活体细胞或组织。

1.3针对血清的拉曼光谱研究 很多研究试图通过检测乳腺癌患者血清来诊断乳腺癌。正常人血清在固定波长的激发强度与癌症患者有差异〔9〕，还有研究发现在某些特定波数癌症患者与正常人有差异〔10〕，但仅仅是差异观察尚不足以证明这种差异。Piehardo-Molina〔11〕、郭丽等〔12〕通过测试11例乳腺癌和12例健康人血清的拉曼光谱，并用主成分分析PCA和线性判别分析LDA方法研究了实验组与对照组的拉曼光谱，发现PCA可以使在不同的波段找出对照组和实验组的差别，可能说明血清的拉曼光谱检测可以用于诊断乳腺癌。

1.4乳腺组织切片的拉曼光谱研究 对于诊断乳腺癌，主要研究对象还是病变组织。最容易获得的标本是石蜡和冰冻切片，研究早期相关报道较多。姚淑霞等〔13〕采用激光共焦显微拉曼光谱议对乳腺癌的病理切片及乳腺良性肿瘤的病理切片进行研究，发现细胞核上的拉曼峰较其他位置明显，癌变组织860/cm处的拉曼峰明显蓝移；1 610/cm处的峰值与1 525/cm处的峰值比反映了病变与正常乳腺组织之间光谱的差异，并提出了以1 610/cm/1 525/cm是否>1.015作为判断乳腺组织是否癌变的标准。但是这种组织切片由于经过了处理，对拉曼光谱结果有很大影响。冯春霞等〔14〕对40例新鲜肿瘤组织及肿瘤组织冰冻切片的拉曼光谱进行对比分析发现，激发光源、样品形态、切片厚度、离体时间、保存条件等因素对肿瘤组织拉曼光谱的采集会造成一定的影响。只有选择合理的参数设置和处理方法，才可能获得理想的拉曼光谱。Faolain等〔15〕比较全面地研究了冰冻、甲醛固定、石蜡包埋和脱蜡对组织拉曼光谱的影响，发现由于冰冻和甲醛固定而出现了新峰，同时氨基化合物波段出现了漂移。因此，采用新鲜组织的研究逐渐取代了对于组织切片的研究。

2 拉曼光谱的临床研究

2.1手术切缘阳性检测 Haka等〔16〕首次将拉曼光谱仪用于体内乳腺组织的拉曼光谱收集，从9例接受部分乳房切除手术的患者乳腺组织残腔内的切缘表面收集了30个拉曼光谱，运用先前体外实验所建立的拉曼诊断模型计算这些拉曼光谱并与病理学结果相比较，该拉曼诊断模型结果的总体准确率为93%(28/30)。该实验初步表明了用拉曼光谱评估术中乳腺切缘的可行性。

Keller等〔17〕设计了一个具有多重偏移探测器的空间位移拉曼光谱探针用来检测35例新鲜冰冻乳腺组织样品，其中13例没有肿瘤组织样品及2例含有肿瘤但是肿瘤距离所测量样品表面的最近距离>2 mm的组织样品被标记为“阴性切缘”；其他15例含有乳腺浸润性导管症(IDC)及5例含有乳腺浸润性小叶癌(ILC)的组织样品(肿瘤距离所测量样品表面的最近距离<2 mm)被标记为“阳性切缘”。由每个探测器所检测的平均光谱创建出一个复合谱，这个复合谱含有组织表面到组织表面下2 mm内所有的生化信息。采用稀疏多项式逻辑回归分析方法将这些复合谱区分为阳性或阴性，然后与这些组织的病理学结果相比较而得出该方法的灵敏度为95%、特异度为100%。到目前为止，国内外文献尚没有对取样速度、样品体积等与实验方法密切相关的方面的阐述，同时诊断的准确性也需要大量的临床病例证实。

2.2乳腺腋窝淋巴结的拉曼光谱研究 拉曼光谱研究淋巴结转移主要是希望将其应用于前哨淋巴结活检。Horsnell等〔18〕采用拉曼光谱检测38例IDC患者的腋窝淋巴结状态，所检测的数据用PCA方法分析后与病理学结果比较，结果表明该方法在鉴别正常与转移性淋巴结时，其灵敏度高达92%，特异性为100%。Sattlecker等〔19〕详细分析了拉曼光谱与多元统计分析方法相结合来评估乳腺癌患者腋窝淋巴结状态的准确性，采用拉曼光谱检测43例乳腺癌患者的腋窝淋巴结，所获得的拉曼光谱数据集来构建不同类型的支持向量机(SVM)模型，包括线性、多项式和径向基函数(RBF)，并与传统的化学计量学方法：线性判别分析(LDA)模型和偏最小二乘判别分析(PLS-DA)模型相对比，结果表明RBF-SVM模型具有高达100%的分类精度，显示了其在应用于临床诊断方面的巨大潜力。

拉曼成像技术〔20〕最早用来评估前哨淋巴结状态并区分其阴阳性时被证实具有91%的灵敏度和93%的特异性。阳性及阴性淋巴结组各平均光谱分析结果表明，与阴性淋巴结相比，阳性淋巴结的DNA及酪氨酸波峰增强而胶原蛋白波峰降低。然而为了精确的测量绘制该拉曼图像，需要12～120 h的测量以获得足够数量的拉曼光谱，这一缺点限制了拉曼成像技术在术中的应用。Horsnell等〔21〕设计了一个探测器模型以较少的拉曼特征光谱评估淋巴结状态，从而实现在期限时间内快速诊断。实验结果表明该拉曼检测系统用于临床术中评估腋窝淋巴结状态的可行性。

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