金属硫蛋白3对快速老化痴呆模型小鼠行为学变化的影响

马飞煜 林 婉 黄林欢 林 麒

(汕头市中心医院暨中山大学附属汕头医院神经内科，广东 汕头 515041)

快速老化痴呆模型小鼠(SAMP8)主要以学习记忆能力障碍为老化特征，是目前公认的比较理想的自然衰老痴呆模型〔1～4〕。快速老化小鼠对照系(SAMR1)表现为正常衰老，一般作为SAMP的正常对照。Morris水迷宫是用来检测啮齿动物的空间学习能力、记忆能力的理想实验系统〔5〕。Uchida等〔6〕首次从人脑组织中分离出金属硫蛋白(MT)3，因其只在脑内特异表达，可能具有重要的神经生理和神经调节功能。临床报道老年痴呆患者脑内MT3含量明显减少〔7〕。本实验应用Morris水迷宫检测MT3对SAMP8小鼠学习记忆变化的影响。

1 材料与方法

1.1 动物分组 实验动物均7月龄，雄性，每组各20只。SAMR1小鼠作为正常组。SAMP8随机法分成痴呆组、空白对照组(0.2 ml/10 g 生理盐水)、低浓度 MT3(75 μg/ml)组、中浓度 MT3(150 μg/ml)组、高浓度 MT3(300 μg/ml)组。由天津中医学院第一附属医院实验动物中心提供。

1.2 实验方法 连续腹腔注射不同浓度MT3及生理盐水28 d，停药1 d后采用Morris水迷宫进行定位航行试验和空间探索试验。Morris水迷宫包括一不锈钢的圆形水池，将水池等分东南西北4个象限，每个象限标记1个入水点;任意将平台设置于某1个象限中间，位置保持不变;一般平台藏于水面下1～2 cm，水温保持在 (22±1)℃。迷宫外参照物在实验期间始终保持不变以供小鼠定位平台。迷宫上方有摄像成像系统，自动录入小鼠游泳轨迹并进行分析。

1.2.1 定位航行试验 试验历时4 d，每天固定时间段，每个时间段训练4次。训练开始时，从池壁4个入水点的任一点将小鼠面向池壁放入水池。摄像系统记录小鼠找到平台的时间(逃避潜伏期)，4次训练即将小鼠分别从4个不同的入水点放入水中。小鼠90 s内找不到平台(潜伏期计为90 s)，则由实验者将其拿上平台，在平台上休息15 s，再进行下一次试验。每日以小鼠4次训练潜伏期的平均值作为当日学习成绩。

1.2.2 空间探索试验 定位航行结束后撤除平台，将小鼠任选1个入水点放入水中，所有小鼠必须为同一入水点，使其寻找记忆中原平台，记录100 s游泳轨迹，计算其穿越原平台次数取平均值。

1.3 统计处理 应用SPSS10.0统计软件进行多组间方差分析和两组间t检验。

2 结果

2.1 各组逃避潜伏期比较 痴呆组逃避潜伏期〔(84.99±5.71)s〕比 SAMR1 组〔(40.98±3.74)s〕明显延长(P＜0.01)，说明SAMP8小鼠具有明显的学习能力下降的特征。低浓度MT3组逃避潜伏期为(76.75±5.42)s、中浓度 MT3 组为(71.02±5.22)s、高浓度 MT3 组(58.45±6.76)s。高浓度 MT3 组在 3 种浓度MT3组当中逃避潜伏期最短(P＜0.05);高浓度MT3组与空白对照组〔(86.52±8.1)s〕相比，逃避潜伏期缩短(P＜0.05)，说明SAMP8小鼠经MT3治疗，学习能力提高，有浓度依赖关系，高浓度作用最强。高浓度 MT3组逃避潜伏期比SAMR1组延长(P＜0.05)，说明经MT3治疗，痴呆小鼠学习能力有改善，但仍未达到正常水平。

2.2 各组穿越原平台次数比较 痴呆组穿越原平台游泳的次数〔(3.29±1.41)次〕明显比 SAMR1 组〔(8.15±1.74)次〕减少(P＜0.05)，说明 SAMP8小鼠具有明显的记忆能力下降的特征。低、中、高浓度 MT3组穿越原平台次数分别是(4.75±1.42)次、(5.02±1.22)次、(6.45±1.76)次。3 种浓度 MT3 组相比，高浓度MT3组最多(P＜0.05);高浓度MT3组与空白对照组〔(3.52±0.91)次〕相比，穿越原平台的次数增多(P＜0.05)，说明SAMP8小鼠经MT3治疗记忆能力提高，有浓度依赖关系，高浓度作用最强。高浓度MT3组穿越原平台次数比SAMR1组明显减少(P＜0.05)，说明经MT3治疗，痴呆小鼠记忆能力有改善，但仍未达到正常水平。

3 讨论

SAMP8小鼠是由日本京都大学Takeda教授开发，以学习记忆功能呈增龄性加速衰退为主要特征，成为了研究老化和学习记忆障碍的理想动物模型〔8～10〕。Morris水迷宫是英国心理学家Morris于1981年设计并应用于脑学习、记忆能力研究的首选经典实验〔5〕。装置实验设计合理，方法简便实用，被广泛应用于学习记忆、老年痴呆、海马研究、智力与衰老等方面的研究。在世界上已经得到广泛地认可，涉及被试动物主要是鼠。主要的实验内容主要包括定位航行试验和空间探索试验。

MT3只存在于中枢神经系统，对其生物学功能的认识，目前概括起来包括以下几个方面:①对Cu、Zn等金属的隔离与分散作用;②调控锌金属蛋白的生物合成及活性;③保护细胞免受自由基伤害;④特定情况下对神经元细胞生长的抑制作用。而目前MT3对AD的保护作用机制尚未清楚，实验发现MT3可以提高SAMP8小鼠海马的抗氧化能力，作用效果与浓度有关〔11〕。并且MT3可通过减少SAMP8小鼠海马Bax表达和增加Bcl-2表达，减少细胞凋亡，保护海马神经元组织结构〔12〕。

1 Okuma Y，Nomura Y.Senescence-accelerated mouse(SAM)as an animal model of senile dementia:pharmacological，neurochemical and molecular biological approach〔J〕.Jpn J Pharmacol，1998;78:399-404.

2 Nomura Y，Okuma Y.Age-related defect s in lifespan and learning ability in SAMP8 mice〔J〕.Neurobiol Aging，1999;20(2):111-5.

3 Han S，Rudd JA，Hu ZY，et al.Analysis of neuronal nitric oxide synthase expression and increasing astrogliosis in the brain of senescence-accelerated-prone 8 mice〔J〕.Int J Neurosci，2010;120(9):602-8.

4 Fernández-Gómez FJ，Muñoz-Delgado E，Montenegro MF，et al.Cholinesterase activity in brain of senescence-accelerated-resistant mouse SAMR1 and its variation in brain of senescence-accelerated-prone mouse SAMP8〔J〕.J Neurosci Res，2010;88(1):155-66.

5 张均田，石成璋，梅堡幸，等.“水迷宫”自动控制仪的研制及在神经药理研究中的应用〔J〕.药理分析杂志，1991;11(1):23-6.

6 Uchida Y，Takio K，Titani K.The growth inhibitory factor that is deficient in Alzhemler’sdisease is a 68 amino acid metallothionein-like protein〔J〕.Neuron，1991;7(2):337-47.

7 Yu WH，Lukiw WJ，Bergeron C，et al.Metallothionein is reduced in Alzheimer’s disease〔J〕.Brain Res，2001;894:37-45.

8 Takeda T.Senescence-accelerated mouse(SAM):a biogerontological resource in aging research〔J〕.Neurobiol Aging，1999;20(2):105-10.

9 Okuma Y，Nomura Y.Senescence-accelerated mouse(SAM)as an animal model of senile dementia:pharmacological，neurochemical and molecular biological approach〔J〕.Jpn J Pharmacol，1998;78:399-404.

10 刘一凡，石学敏，韩景献，等.快速老化脑萎缩模型小鼠脑抗氧化酶活性增龄性变化的研究〔J〕.中国老年学杂志，2003;23(7):462-3.

11 马飞煜，张 昱，何 雨，等.金属硫蛋白对快速老化痴呆小鼠海马抗氧化损伤作用的研究〔J〕.中风与神经疾病杂志，2007;24(1):59-60.

12 马飞煜，王 凤，王 虎，等.金属硫蛋白3对快速老化痴呆模型小鼠海马CA1区神经元细胞凋亡的影响.〔J〕.中国老年学杂志，2009;29(12):1503-5.