结核生物蛋白芯片在结核病早期诊断中的应用

刘 伟

（吉林省白城市传染病医院，吉林 白城 137000）

结核生物蛋白芯片在结核病早期诊断中的应用

刘 伟

（吉林省白城市传染病医院，吉林 白城 137000）

目的通过分析结核分枝杆菌LAM、16KD、38KD抗原的IgG抗体说明其检出率和早期诊断意义。方法对2013年1月至2013年5月来白城市传染病医院门诊和住院的就诊229例患者分别应用蛋白芯片法进行定性检测，随机抽取其中96例阳性者进行痰涂片抗酸染色法定性检测。结果在229例血清检测标本中，结核抗体阴性标本者114例，结核抗体阳性者115例，检出的阳性率为50.22%。随机选择96例蛋白芯片法检测阳性者做痰涂片抗酸染色法定性检测，痰涂片阳性者仅为17例，阳性率仅为17.71%。结论作者认为采用生物蛋白芯片技术联合检测3种结核抗体，可提高其诊断结核病的敏感性和特异性，并作为结核病的血清学早期诊断方法之一。

结核分枝杆菌；LAM抗原；16KD抗原；38KD抗原；IgG抗体；蛋白芯片技术；早期诊断；痰涂片；比较性分析

结核病是由结核分枝杆菌引起的一种常见慢性传染病，可见于全身的各个组织器官，但以肺结核最多见。据统计，全球现有活动性肺结核患者2000多万，我国有4亿人感染过结核菌，是世界上22个结核病高负担国家之一，患者人数居全球第二位。X线检查、痰液微生物学检查和蛋白芯片法是白城市传染病医院临床诊断结核病的主要方法，其中蛋白芯片法是近年来蛋白质组学研究中兴起的一种新方向，其基本原理是以微孔滤膜为载体，利用微阵陈列技术将纯化的结核菌脂阿拉伯甘露糖（LAM）蛋白，16KDa（rTPA16）和38KDa（rTPA38）等3种抗原固相于同一膜片上，在固相膜上使抗原抗体反应快速进行，在以免疫全作为标志物在膜上显色，然后放入芯片阅读仪，在专门软件的支持下对抗原点阵以灰度值进行分析，以达到检测结核杆菌的目的。本文以结核生物蛋白芯片法检测2013年1月～5月期间来白城市传染病医院门诊和住院的就诊229例患者的血液标本，在统计阳性率的基础上，与痰液微生物定性检查结果相比较。现将结果报道如下。

1 资料与方法

1.1 标本来源

以2013年1月至2013年5月来白城市传染病医院门诊和住院的就诊229例患者为研究对象，其中男性131例，女性98例。常规采集静脉血液标本待应用蛋白芯片法检测，并随即选择96例阳性者进行痰涂片抗酸染色法检测。

1.2 仪器及试剂

南京大渊生物技术工程有限责任公司生产的PBT-X4型生物芯片识别仪，结核分枝杆菌IgG抗体检测试剂盒（蛋白芯片）。

1.3 操作方法

取静脉血2 mL，分离血清，在芯片上标记上样品编号，在芯片盒窗口内滴加200 μL试剂A，使膜表面完全浸湿；待血清完全渗入后，室温放置1 min。将待检血清100 μL加入窗口中，待血清完全渗入后，再滴加300 μL试剂B，待试剂B完全渗入后，滴加500 μL试剂C，待试剂C完全渗入后，最后滴加300 μL试剂D，反应完毕后30 min内将芯片放入芯片识别仪进行结果分析，在确保没有开启任何应用程序的情况下，把芯片盒内的小光盒放入光驱，机器会自动进入生物芯片检测软件，然后按程序操作，并打印出分析结果。痰液微生物检查主要采用涂片抗酸染色法，操作方法参见《结核病诊断细菌学检验规程》[1]。

1.4 结果判定

LAM、16KDa、38KDa的IgG抗体有任一指标为阳性，均确定为结核分枝杆菌感染。如IgG抗体均为阴性，提示未感染结核分枝杆菌。

2 结 果

2.1 蛋白芯片法检测结果

在229例血清检测标本中，结核抗体阴性标本者114例，结核抗体阳性者115例，检出的阳性率为50.22%。其中，16Kda、38Kda和LAM均阳性者10例，单纯16Kda阳性者4例，单纯38Kda阳性者5例，单纯LAM阳性者19例，16Kda和LAM阳性者6例，38Kda和LAM阳性者71例。

2.2 蛋白芯片法与痰涂片抗酸染色法定性检测结果比较

在115例蛋白芯片法阳性标本中，随机选择96例进行痰涂片抗酸染色法定性检测，其中痰涂片阳性者为17例，阳性率仅为17.71%。

3 讨 论

结核病是世界卫生组织和我国重点防治的重大传染病之一[2]。早期结核病患者均有非特异性的一般症状，目前在肝脏、胰腺、肾脏、腹膜和骨骼等组织器官感染结核分枝杆菌的机会较高，肺外结核的发病率越来越高，有时传统的诊断方法的假阴性率较高，致使大量结核病患者未能及时被及时诊断而延误治疗时机，这是目前结核病病死率急剧升高的重要原因之一。因此，如何早期诊断结核病，成为提高人群尤其是高危人群和患患者群健康水平一个重要手段，是结核病第二级预防的重要手段和措施。由于痰吐法、培养法和皮试法等诊断手段有的所需时间长，有的检出阳性率低，因此，世界卫生组织要求各个国家和地区进一步开发新的体外诊断试剂，生物蛋白芯片技术为一种重要的手段之一。

生物蛋白芯片技术检测结核分枝杆菌抗体较敏感和特异的纯化抗原为细胞壁LAM、16KDa蛋白和38KD蛋白，LAM是构成结核分枝杆菌细胞壁的重要组成成分，其特异性强，能刺激结核感染者产生抗体。16KDa蛋白是有潜力的免疫诊断抗原，38KDa蛋白为脂蛋白，其与细胞膜或菌体表面的脂肪结构相连。结核病的免疫特征是细胞免疫功能低下，体液免疫功能增强。当治疗有效，感染控制后，LAM、16KDa、38KDa抗体水平下降。

生物蛋白芯片技术检测结核分枝杆菌的基本原理为：本文结果表明，229例门诊及住院结核病患者的结核分枝杆菌抗体检出率均高，尤其是LAM阳性者较高（为106例），占阳性总数的92.17%，提示血清LAM抗体是诊断结核病的重要标志之一[3]，其诊断的特异性较高[4]；本文结果说明生物蛋白芯片技术能动态监测这3种结核抗体，可用于结核病的药物治疗选择的客观依据；本文还显示LAM、38KDa抗体检出率随结核病患者的年龄增加而升高，可能与年龄增加机体抵抗力或免疫力下降。在115例标本中蛋白芯片法阳性标本中，随机选择96例痰涂片抗酸染色法定性检测，其中痰涂片阳性者为17例，阳性率仅为17.71%。说明，生物蛋白芯片技术有助于结核病的早期诊断。

综上观点，作者认为采用生物蛋白芯片技术联合检测3种结核抗体，可提高其诊断结核病的敏感性和特异性，并作为结核病的血清学诊断方法之一。生物蛋白芯片技术应用于结核分枝杆菌抗体的检测，不仅可以快速准确地检测血清中的相关各种抗体，而且还可以在不同人群中筛查出不同的抗体类型，为临床结核病尤其是肺外结核的诊断及预后估测等提供重要的依据。

生物蛋白芯片技术检测结核分枝杆菌抗体适用于：①用于活动性结核病菌感染引起的疾病特异性抗体检测，可作为结核病的血清学诊断方法之一。②非活动性感染及接受过卡介苗接种者。③痰涂片、培养检测为阴性的人群检测。④肺部其他疾病的鉴别诊断和结核病化疗后的动态观察。

应用该方法时，对标本有严格要求：①静脉血清体积应在150 μL以上；②溶血标本和高脂血样本不适宜本方法；③新鲜血样在2～8 ℃环境下存放不要超过48 h；④长期保存的样本应在-20 ℃以下保存，避免冷冻和反复冻融。

在检测过程中应注意：①2～8 ℃环境下取出的芯片和试剂需在室温下平衡10 min方可使用。②每盒芯片配套1张校正光盘，只对该盒内的芯片有效，不能与其他芯片混用；芯片反应窗口膜不能损伤或受潮。③芯片阳性控制点不显色，说明已经失效，应取一新芯片重做。④残余标本和用过的芯片，按照生物危险品进行常规消毒处理。⑤操作时必须戴手套，检测完毕彻底洗手。⑥眼部如接触任何试剂，立即大量清水冲洗，如仍有不适，应立即就医。

该方法的优点表现在：①检测速度快，适合快速诊断要求。试剂稳定，不同的检测单位和不同批号的试剂检测可获得稳定一致的结果。②可以单人份操作，既可以方便患者又可以节约试剂。③结果的判断采用芯片识别仪避免了人为主观误差。其缺点表现在：①价格相对昂贵，不适用于大规模血清流行病学调查。②标本必须新鲜，对于黄疸血清和溶血标本亦可出现假阴性结果。③重症结核患者，当其免疫力极度低下时可能无法检出抗体。

对结核病做出快速而准确的诊断，一直是临床工作中的重点和难点，探索更有特异性、敏感性、实用性的实验诊断的指标和方法具有重要的意义。本文的观察结果表明，生物蛋白芯片技术是可被选择的手段之一，对结核病的早期诊断有一定意义。

[1] 中国防痨协会.结核病诊断细菌学检验规程[J].中国防痨杂志, 1996,18:18-31.

[2] 张秀珍,胡云建,陈东科.结核病实验诊断进展[J].中华检验医学杂志,2005,28(8):865-866.

[3] 汪伟明,周国平,张钢.血清LAM-IgG抗体对结核病的诊断价值[J].中国血液流变学杂志,2001,11(3):219-220.

[4] 孔忠顺,管波清,古淑香,等.血清抗脂阿拉伯甘露糖及38kDa抗体检测对涂阴肺结核及肺外结核诊断价值[J].中国防痨杂志, 2002,24(3):140-142.

R52

B

1671-8194（2014）13-0197-02