布鲁氏菌弱毒疫苗鉴别技术研究进展

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（1.中国动物卫生与流行病学中心，山东青岛　266032；2.　扬州大学，江苏扬州　832000）

布鲁氏菌弱毒疫苗鉴别技术研究进展

南文龙1，谭鹏飞1，2，彭大新2，陈义平1

（1.中国动物卫生与流行病学中心，山东青岛266032；2.扬州大学，江苏扬州832000）

布鲁氏菌病是由布鲁氏菌引起的一种重要的人畜共患传染病，不仅给畜牧业造成严重的经济损失，并威胁人类健康。弱毒疫苗免疫是防控布病的重要手段，但弱毒疫苗的使用往往对布病的诊断和监测造成干扰。各国学者利用细菌学、免疫学、分子生物学等技术手段，建立了病原分离鉴定、补体结合试验、利凡诺尔试验、酶联免疫吸附试验、荧光偏振实验、限制性片段长度多态性、PCR、real-timePCR等多种布鲁氏菌弱毒疫苗鉴别检测方法。研究表明，ELISA和FPT以其高通量以及操作方便的优势，在布鲁氏菌弱毒疫苗与野生菌株感染的血清学鉴别诊断方面前景良好；分子生物学特别是PCR、real-timePCR方法目前仍广泛用于布鲁氏菌纯培养物的鉴定。

布鲁氏菌；弱毒疫苗；鉴别；疫苗免疫；研究进展

布鲁氏菌病（Brucellosis）是由布鲁氏菌（Brucella）引起的人畜共患传染病。布鲁氏菌可感染人和多种家畜、野生动物，对畜牧业健康发展和公共卫生安全均构成威胁[1]。近年来，布病疫情在世界范围内呈反弹趋势，2011年我国布病发病人数为38151人，为历年新高[2]。疫苗免疫是防控布鲁氏菌病的主要措施之一，布鲁氏菌弱毒疫苗免疫效果好、免疫保护持续时间长、成本较低，布鲁氏菌弱毒疫苗的推广应用在布病防控过程中发挥了积极作用。当前，国外常用的弱毒疫苗株包括S19、RB51、Rev.1；中国常用的弱毒疫苗株包括A19、S2、M5、104M，但弱毒疫苗的使用往往对布鲁氏菌病的诊断和监测造成干扰。各国学者利用细菌学、免疫学、分子生物学等技术手段，从病原和血清抗体两方面，建立了多种布鲁氏菌弱毒疫苗株与野生菌株的鉴别检测方法，本文就相关研究进行简要综述。

1　细菌学检测方法

病原分离鉴定是诊断布鲁氏菌病的经典方法，广泛应用于布鲁氏菌种和生物型的鉴定。但由于布鲁氏菌生长缓慢，所需营养条件复杂，分离培养需在P2级以上生物安全实验室进行，且细菌学方法不能有效鉴别与疫苗株同生物型的野生分离株，该方法应用于布鲁氏菌疫苗株的鉴别具有局限性。

2　免疫学检测方法

2.1补体结合试验（complementfxationtest，CFT）

CFT最早应用于布鲁氏菌弱毒疫苗鉴别的检测方法，原理是基于弱毒疫苗免疫和野生菌株感染后产生的特异性IgG和IgM抗体具有产生量、时相的差别。Allangs等[3]分别用布鲁氏菌弱毒疫苗和野生菌株接种豚鼠，发现疫苗免疫接种后，大约5天产生IgM抗体，2周后可达高峰，IgG抗体在4周左右达高峰，以后逐渐下降；而野生菌株接种后，IgM抗体很快下降，IgG抗体的高峰期可维持270天，1年后仍能维持在可检测水平。血清抗体IgG的长期持续存在，也是慢性布鲁氏菌感染病例的一项指征[4]。由于CFT主要检测IgG类抗体，应用于布鲁氏菌弱毒疫苗免疫和野生菌株感染的鉴别，需要多次采集血清样品进行检测与比较，耗时较长，操作过程较为繁琐。

2.2利凡诺尔试验（rivanoltest，RIV）

RIV是重要的布鲁氏菌弱毒疫苗鉴别方法，应用乙氧基-6，9-二氨基吖啶黄乳酸盐作为还原物质，沉淀消除血清中IgM类抗体和血清白蛋白，而保留IgG类抗体。经利凡诺尔处理的血清，处理前后血清抗体滴度不发生明显变化，说明血清中主要是IgG类抗体；处理前后血清抗体滴度下降明显，说明血清中含有大量IgM类抗体，可能是疫苗免疫接种所致，可做疫苗免疫与野生菌株感染鉴别的参考依据。Heck等[5]对863份S19疫苗免疫牛血清和非免疫牛血清共4551份进行检测，结果RIV与CFT符合率达到91%～100%。与CFT相比，在慢性布鲁氏菌病血清学诊断方面，RIV简便易行，适用于基层检疫。国内学者利用RIV方法对M5疫苗免疫和野生菌株感染血清进行了有效区分[6]。

2.3二巯基乙醇凝集试验与L-半胱氨酸凝集试验

二者均是用适当浓度的巯基化合物破坏IgM抗体的双硫键，从而失去凝集活性，而小分子IgG抗体则不受影响，从而区别布鲁氏菌弱毒疫苗免疫与野生菌株感染。阎守敦等[7]应用该方法对Rev.1、M5疫苗免疫和野生菌株感染血清实现有效区分。L-半胱氨酸凝集法操作简单，可在现场进行，方便现地诊断[8]。

2.4酶联免疫吸附试验（ELISA）

许多国内外学者致力于建立ELISA方法进行布鲁氏菌弱毒疫苗免疫和野生菌株感染的鉴别，技术形式包括间接ELISA（indirectELISA，iELISA）、 竞 争ELISA（competitiveEILSA，cELISA）、夹心ELISA（sandwichELISA，sELISA）等，技术原理可分如下三类：

2.4.1粗糙型的布鲁氏菌弱毒疫苗由于O-多糖的缺失，其免疫血清与O-多糖抗原没有反应性或反应性较小，可以通过ELISA方便的实现其鉴别，如对RB51疫苗[9]。

2.4.2根据特异性IgG和IgM抗体产生量、时相、反应性的差别，可以通过ELISA实现光滑型的布鲁氏菌弱毒疫苗鉴别。布鲁氏菌S19疫苗免疫后，机体迅速清除病原，IgG抗体高峰出现后即迅速下降。基于此，Nielsen等[10]以多糖作为抗原，建立了iELISA、cELISA方法，可以区分S19免疫与自然感染血清。但若出现S19持续感染的情况，则无法进行区分。与iELISA相比，cELISA方法因能区分耶尔森菌O:9抗原引起的假阳性结果，而更具优势。阎守敦等[7]建立了改良的ELISA方法，对被检血清先用2-巯基乙醇处理后再进行检测。应用该方法和试管凝集试验平行检测疫苗免疫羊血清1366份，结果显示改良ELISA检测结果均为阴性，而试管凝集试验阳性检出率为39%。证实该方法可用于鉴别M5疫苗免疫与野生菌株感染血清。布鲁氏菌慢性感染过程中，会伴随着特定IgG亚型—高水平IgG2类抗体的持续存在。Ana[11]等根据蛋白A对IgG2具有高度的亲和能力，蛋白G可同时结合IgG1和IgG2两种亚类抗体的特点，以S-LPS作为包被抗原，分别应用蛋白A或G耦联过氧化物酶作为二抗，建立了iELISA方法，该方法可以将S19疫苗免疫血清与自然感染血清进行有效区分。

2.4.3针对布鲁氏菌全菌或组分制备单克隆抗体，利用单抗的高度特异性进行可以进行鉴别检测。Gorrell等[12]用福尔马林灭活的牛种布鲁氏菌544A作为免疫原，获得单克隆抗体Br.25，该单克隆抗体能与牛种布鲁氏菌生物1型和2型结合，而不能与S19疫苗、猪种布鲁氏菌、羊种布鲁氏菌及绵羊附睾种布鲁氏菌结合。用该单抗建立夹心ELISA法，结果显示大多数感染牛为阳性，而非感染牛、免疫牛及未免疫牛均为阴性。

2.5电泳鉴别试验

布鲁氏菌弱毒疫苗免疫和野生菌株感染抗体存在血清球蛋白成分及其含量的差异，可利用电泳技术将其区分。阎守敦等[7]将2-巯基乙醇处理后的血清进行聚丙烯酰胺凝胶电泳，检测野生菌株接种动物的血清512份，弱毒疫苗接种的动物血清1120份，健康对照血清272份。结果显示，阴性血清全部表现为3条区带，野生菌株接种的阳性血清全部表现为4条区带，疫苗接种的阳性血清全为5条区带，证明该方法可用作鉴别疫苗免疫与野生菌株感染血清。

2.6荧 光偏 振 实 验（fuorescencepolarization test，FPT）

Gall等[13]以荧光素标记的流产布鲁氏菌O-多糖作为抗原，对2087份北美野牛血清进行FPT检测，并与cELISA进行比较。结果表明，cELISA与FPT敏感性分别为89.5%和92.1%；特异性分别为95.5%和99.4%，FPT比cELISA更为敏感特异。而通过建立合适的cut-off值，FPT可以实现S19疫苗免疫血清的鉴别。

3　分子生物学方法

3.1限制性片段长度多态性（restrictionfragment lengthpolymorphism，RFLP）

Jensen等[14]运用核酸内切酶XbaI消化布鲁氏菌基因组，建立了RB51疫苗与野生菌株的鉴别方法。通过RFLP，利用Rev.1疫苗omp2基因上限制性内切酶PstI多态性差异或rpsL基因上NciI酶切位点的缺失突变，可实现Rev.1疫苗和野生菌株的有效鉴别[15-16]。我国学者利用该方法，实现了M5疫苗与羊种强毒株16M的鉴别[17-18]。

3.2多位点可变数目串联重复序列分析（multiple-locusvariablenumbertandemrepeatanalysis，MLVA）

姜海等[19]应用MLVA聚类分析法，首次对S2疫苗与17株猪种布鲁氏菌生物1型分离株进行了基因分型比较。结果显示，这17株分离株可分为2个基因群，其中基因2群又可分为3个基因型，S2疫苗为基因2群的2型分支，通过该方法可将S2与其它基因群、基因型的分离株进行区分。

3.3PCR

Vemulapalli等[20]根据RB51疫苗中IS711元件阻断编码O抗原糖基转移酶的wboA基因这一特性，建立了RB51疫苗和野生菌株的PCR鉴别方法。David等[21]建立了可快速鉴别布鲁氏菌疫苗株S19、RB51和Rev.1的多重PCR。谷文喜等[22]通过PCR扩增VirB8基因，测序分析，证实牛种（544A、A19）和羊种（M5、Rev1）分别各自在相同部位发生了相同的碱基突变，VirB8基因有可能做为布鲁氏菌疫苗株的鉴定分类基因。钟旗等[23]利用牛种疫苗株A19与其它牛种布鲁氏菌株Ery基因序列存在的差异碱基，建立了聚合酶链反应-单链构象多态性分析方法，结合运用牛种I型菌株鉴别方法，可实现疫苗株A19与野生菌株的鉴别。

3.4基于单核苷酸多态性（singlenucleotidepolymorphism，SNP）的Real-timePCR

Gopaul等[24]对疫苗株S19、RB51、Rev.1基因组进行SNP分析，并依此建立了基于MGB探针的Real-time检测方法。结果显示，该方法与已有的分子检测方法相比，如PCR、RFLP等，具有更高的检测精确性，快速、可靠地实现了上述3个疫苗株与野生菌株的鉴别检测。

综上所述，ELISA和FPT以其高通量以及操作方便的优势，在布鲁氏菌弱毒疫苗与野生菌株感染的血清学鉴别诊断方面，具有良好的应用前景。但是对于未知背景的血清样品来说，单次检测仍不能确切分辨疫苗免疫或野生菌株感染。分子生物学方法，特别是PCR、real-timePCR，可有效实现弱毒疫苗与野生菌株的分子鉴别，但是目前仍主要应用于布鲁氏菌纯培养物的鉴定。

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ResearchAdvancesinIdentifcationofAttenuatedBrucella Vaccines

NanWenlong1，TanPengfei1，2，PengDaxin2，ChenYiping1
（1.ChinaAnimalHealthandEpidemiologyCenter，QingdaoShandong266032；2.YangzhouUniversity，YangzhouJiangsu225009）

BrucellosisisacrucialzoonosiscausedbyBrucella.Itisresponsibleforsubstantialeconomiclossesand posesathreattohumanhealthaswell.Immunizationwithattenuatedvaccineshasprovedtobeaneffectivemethodfor itsprevention；however，itmayinterferewithitsdiagnosis.Usingbacteriology，immunologyandmolecularbiology techniques，manyidentifcationassaysforattenuated Brucellavaccineswereestablished，suchaspathogenisolation andidentifcation，complementfxationtest，rivanoltest，ELISA，fuorescencepolarizationtest，restrictionfragmentlengthpolymorphism，PCR，real-timePCRandsoon.Thesestudiesindicatedthatwiththeadvantagesofhigh throughputandeasyoperation，ELISAandFTPhavegoodprospectsinserologicalidentifcationofattenuatedBrucella vaccines.Moreover，molecularbiologicalmethods，especiallyPCRandreal-timePCR，arestillwidelyusedforidentifcationofthepurecultures.

Brucella；attenuatedvaccine；identifcation；vaccine；researchprogress

S851.34

：B

：1005-944X（2014）08-0032-04

青岛市科技成果转化引导计划（14-2-4-79-jch）南文龙、谭鹏飞都为第一作者

陈义平