外泌体在心血管疾病中的研究进展*

肖 静， 余细勇

(1广东省人民医院，广东省医学科学院医学研究中心, 广东 广州 510080； 2南方医科大学药学院,广东 广州 510515)

人体诸多生理功能的发挥是通过细胞间的信息交换来完成的。目前细胞之间的信息交换涉及的机制较为复杂，其中比较重要的有分泌生长因子、各种小分子物质(多肽类、生物活性脂类和核苷酸)、细胞间接触和分泌到胞外的基质成分等。新近发现的外泌体 (exosomes)作为一种细胞分泌到胞外的囊泡状小体，自发现以来就不断引起研究者的兴趣。近年来对于exosomes参与心血管疾病生理及病理过程的机制探索以及将基于exosomes的研究转化于临床心脏疾病的诊治已成为研究前沿和热点。

1 Exosomes的基本情况

Exosomes是由多种细胞分泌的双层模型结构的囊性小泡，直径为30～100 nm，是已发现的众多胞外微粒体的一种。Exosomes由Johnstone等[1]在1987年首次从网织红细胞的培养上清液中分离出来，之后的研究不断发现其它多种类型细胞也可以分泌exosomes, 如: T 细胞[2]、B 细胞[3]、树突状细胞[4]以及其它非血源性细胞如肿瘤细胞[5]、施旺细胞[6]，甚至在其它体液中也可见，如尿液[7]。Exosomes的产生机制十分复杂，涉及到多种因子的调控作用。目前大多数研究者比较认同的机制是：细胞在内吞时形成的多泡体(multivesicular bodies, MVBs)，在胞外分泌的过程中，MVBs包含的腔内囊泡(intralumenal vesicles, ILVs)可以从MVBs的内腔释放到胞外环境中，而释放的这些30～100 nm的ILVs就是exosomes[8]。

细胞分泌的exosomes内包含许多遗传物质和蛋白质，exosomes到达胞外后可作用到靶细胞，从而在细胞间信息传递以及免疫调节等过程中发挥着复杂的调节作用。Exosomes内的DNA或RNA可以通过exosomes传递到邻近细胞，引起周围细胞基因表达的改变[9]；来源于exosomes的微小RNA(microRNA，miR)在干细胞分化的调控(let-7)、胚胎发育和器官发生(miR-1)、造血(miR-181)和肿瘤发生(miR-17、-18、-19、-19b等)等生理和病理生理过程中起关键调节作用[10]；exosomes内的脂质对于维持其正常的结构和功能也有重要作用；另外，exosome还含有4次跨膜蛋白超家族(CD9、CD63、CD81、CD82)可以作为识别不同来源exosomes的蛋白分子标记，以及具有功能的热休克(heat shock protein,HSP)蛋白超家族(HSP70、HSP90)等。

2 Exosomes的生理学功能

自从Raposo等[11]在1996年发现免疫细胞也可释放exosomes后，免疫学家就推测exosomes可能具有潜在的免疫调节功能，且在后续研究中逐渐得到证实。有研究者发现从抗原免疫小鼠的血浆中分离出的exosomes可以抑制Th1型超敏反应和Th2型过敏反应的应答[12]。Wan等[13]发现激活小鼠的树突状细胞可以通过释放exosomes而直接增加B细胞的效应作用。成熟突状细胞来源的exosomes膜上有缩氨酸耐受的MHCⅠ和MHCⅡ类分子，可以直接和T细胞受体结合，激活CD4+或CD8+T细胞进而引起一系列的免疫应答[14]。

多种细胞来源的exosomes内均包含mRNA和miRNA，并且诸多研究已证实它们在exosomes参与细胞之间信息传递的作用机制中确实起到重要作用。根据一个专门收录与exosomes研究相关的数据库ExoCarta(http://www.exocarta.org/)中的信息[15]，现已发现的exosomes相关miRNA的种类为764种，包括let-7、miR-1、miR-15、miR-16和miR-181及各种亚型。这些来源于exosomes的miRNA在生物体许多系统均有一定作用。神经元来源的exosomes内包含丰富的miRNA，这些exosomes可以直接内化进入星形胶质细胞中并增加miR-124a和谷氨酸转运蛋白1(glutamate transporter 1,GLT1)蛋白的水平；在培养的星形胶质细胞直接转染miR-124a也可以显著增加GLT1蛋白(但不是mRNA)表达的水平[16]。

3 Exosomes与心血管疾病

在发现exosomes早期，研究者较多地聚焦于exosomes在肿瘤中发生发展机制中的重要作用。许多研究结果证实了exosomes是参与癌细胞和正常细胞信息交流的重要物质，多种细胞因子(如白细胞介素、肿瘤坏死因子超家族等)通过exosomes的携带作用进入肿瘤细胞微环境从而发挥血管生成及肿瘤细胞转移等过程。近年，随着对exosomes研究的深入，已证实exosomes调控的细胞间信息交流过程也广泛参与了心血管系统的生理及病理过程，并在心血管疾病发生发展机制中扮演重要角色。

心脏球(cardiospheres，CSs)是体外培养心脏组织所获得的自我聚集为球形的细胞集落。研究发现心脏球和心脏球来源的细胞(cardiosphere-derived cells，CDCs)均可以分泌exosomes，且这些exosomes和其它微粒体一起在成年心脏组织与异体细胞间的交流中发挥重要作用[17]，尤其在telocytes(一种在干细胞微环境中已发现具有信息传递功能的间质细胞)及其它常驻性心肌祖细胞(resident progenitor cell)之间[18-19]。Vrijsen等[20]研究证实来源于心肌祖细胞的exosomes在体外抓伤实验中能够促进内皮细胞的迁移，提升的内源性心肌的再生能力。心肌成纤维细胞分泌的exosome能够在心肌细胞周围引起特定的效应。当用心肌成纤维细胞的条件培养基培养心肌细胞时，会改变神经冲动的传导从而改变心肌细胞内Na+离子通道和内向整流K+通道的表达水平[21]。随后，研究者还发现心肌细胞exosome能够向其它某些细胞传递DNA和RNA：Waldenstrom等[9]分别用碘化丙啶和吖啶橙示踪DNA和RNA，在体外将遗传物质标记后的exosome导入成纤维细胞中，孵育3 h后，激光共聚焦显微镜结果提示来源于外生exosome的DNA和RNA已经被成纤维细胞内化。

除了心肌细胞能够分泌exosomes之外，内皮细胞分泌的exosomes在心血管形成机制中有重要作用。van Balkom等[22]研究发现内皮细胞来源的exosomes包含的miR-214 在邻近靶细胞内通过沉默毛细血管扩张性共济失调突变从而刺激血管生成。主动脉内皮细胞所产生的包含HSP-70的exosomes可以选择性地激活单核细胞，但是在其它类型的内皮细胞中未见类似报道[23]。内皮细胞exosome来源的HSP70可以募集单核细胞引起炎症反应，提示exosome在细胞炎症反应中起主要作用，对人微血管内皮细胞在缺氧和高糖状态下产生的exosomes进行指纹分析，发现其包含1 354种蛋白质和1 992种信使RNA，参与了常驻性心肌细胞的胞内压力应激反应[24]。此外，内皮细胞分泌的包含miRNA的微泡参与了内皮细胞与平滑肌细胞共培养时2种细胞之间的信息交流过程，有助于体内对抗动脉粥样硬化、保护血管内皮的作用[25]。

此外，大量研究发现当心肌细胞处在某些病理状态(如心肌缺血性损伤等)时，exosomes也参与其中，它或导致其它邻近细胞病理改变，或提供某些保护性因子。例如Kuwabara等[26]研究发现急性心肌梗死和心绞痛病人血浆exosomes中miR-1和miR-133a的表达水平较正常人显著升高。因而心肌细胞的exosomes或可以作为信息传递的载体，心肌内某致病基因一旦出现表达的改变，将可通过exosomes将这一变化转递到周围的细胞。Exosomes内所包含的组蛋白是其来源细胞分泌的所有组蛋白中的一部分，有研究提示心肌成纤维细胞分泌的组蛋白可以在体外缓解再灌注心脏的缺血性损伤[27]；但进一步却发现，条件培养基的心脏保护性效应只有在培养基内存在分子量大于50 kD的碎片时才出现。对这一现象可能的解释是成纤维细胞分泌的exosomes足够容纳分子量在50 kD以上的片段，像血管紧张素Ⅱ和内皮素1[27]这类的低分子量心肌保护性因子，可以在50 kD大小的碎片中单独表达，也可以包装在exosomes之中到达靶细胞后发挥效应。另外，心肌细胞在乙醇、高糖等非正常条件刺激下可以增加exosomes的分泌量[28]，这一现象提示当心肌细胞处于某些病理条件下时，心肌损害的出现可能同其本身所释放出的exosome有关。

4 Exosomes对心肌疾病的治疗潜能

目前对于心血管系统来源的exosomes功能的研究还处于初始阶段，但是exosomes作为缺血性心肌疾病的治疗潜能已得到初步证实。

最近，有研究者采用微泡作为药物传递系统，利用exosomes特异定位细胞的能力治疗某些疾病[29]，该药物传递系统甚至可以传递遗传物质到靶细胞[10]。这个方法与exosomes模拟物不同，后者采用人工合成的exosomes，其内容物只包含基本的定位成分，并且将其它内源性成分(endogenous cargo)减到最少[30]。这个药物传递系统同目前利用脂质体进行药物传递的方法非常相似[31]，但是，相比一般的脂质体药物传递系统，exosomes具有靶向特定的细胞甚至细胞亚群的优势。例如，含有外生siRNA的exosomes可以通过血脑屏障传递其内容物到达特定的神经靶细胞、小胶质细胞、少突胶质细胞，使这些细胞内特定的转录和翻译水平下调[32]。使用exosomes还可以提高药效，当exosomes内被装上外源性curcumin(一种消炎药)，可以观察到该药的生物利用度、溶解度及稳定性都明显提高[33]，在由脂多糖诱导的感染性休克的小鼠模型中，exosomes传递的curcumin可以减少炎症细胞因子IL-6和肿瘤坏死因子α的浓度，从根本上提高细胞在感染性休克状态下的生存率。类似的策略可以利用exosomes表面的蛋白靶向心肌细胞，以期能够提高药物作用的专一性，减少治疗副作用。Exosomes作为药物的传递系统克服了药物生物利用率低的缺点，为靶向性特异治疗提供了全新的方法。

近年来，除了作为药物传递体的应用价值外，exosomes作为信息载体应用于疾病的治疗以及在再生医学方面的应用前景也得到初步体现。研究发现干细胞分泌的exosomes具有心肌保护作用[34]，间充质干细胞(mesenchymal stem cells，MSCs)分泌的exosomes可以保护心肌组织免受缺血与再灌注的损伤[35]、缩小心肌梗死中梗死心肌的范围[36]以及急性肾小管损伤的范围[37]。在猪缺血再灌注模型中，来源于间充质干细胞和胚胎干细胞分泌的exosomes也有类似研究发现，这种细胞产生的exosome可以缩小心肌梗死范围，提高心功能[38]。Manole等[39]在心梗周围区域发现有来源于telocytes的exosomes出现，提示其可能有潜在的血管生成功能。本课题组近期研究发现Sca-1+干细胞通过热休克(42 ℃处理3 h)处理后，其存活率可显著提高；我们进一步研究发现热休克干细胞通过exosomes分泌热休克因子1(heat shock factor 1)到胞外并作用于处于缺血状态的心肌细胞，使心肌细胞凋亡减少，从而显著改善心功能，这一研究对研发心肌保护药物及解决干细胞移植治疗心肌梗死的瓶颈问题具有重要临床意义[40]。另外，在心脏受到损伤时，除了干细胞分泌保护性作用的exosomes外，Chen等[41]研究者证实心肌祖细胞分泌的exosomes也可以保护缺血的心肌细胞不受急性缺血再灌注的伤害，因此心肌祖细胞来源的exosomes治疗心脏疾病或同样具有广泛的前景。

5 展望

对于缺血性心肌病，干细胞疗法具有广泛的应用前景，但是宿主细胞对外来干细胞的排斥以及干细胞进入体内后细胞的完整性被破坏是运用干细胞疗法主要的困难与挑战。目前研究热点正立足于运用exosomes解决干细胞在治疗缺血性心脏病中面临的干细胞存活率问题，以有利于心肌保护性药物治疗靶点的探索和完善。因此，心血管系统exosomes的研究对于了解心脏细胞之间的通讯机制、疾病的发生发展过程、探寻心血管疾病潜在的分子标记物以及优化心脏疾病的诊治均具有重要的临床意义。此外，通过心脏exosomes的研究技术与思路，对我们攻克其它难治性疾病(如恶性肿瘤、免疫系统疾病等)也具有借鉴和指导意义。

[参 考 文 献]

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