朱 彬,张万江
近年来随着人口的增长和流动、与HIV的伴发感染、卡介苗免疫效率的不稳定、以及耐药性菌株的日益增多,全球结核病疫情再度回升。尤其是耐多药结核病(multidrug-resistant TB,MDR-TB)、广泛耐药结核病(extensively drug-resistant TB,XDR-TB),以及全耐药结核病(totally drug-resistant TB,TDR-TB)的出现,给结核病的的防控工作造成了巨大的压力[1]。结核病的耐药机制除了与药物因素引起结核分枝杆菌染色体上某些基因的突变等有关外,还与非药物因素有关,如结核分枝杆菌的滞留特性、主动外排系统的功能、宿主体内复杂的微环境等;即非药物因素也是导致结核分枝杆菌耐药发生的重要原因。
蛋白酶体途径是真核细胞中除溶酶体外降解蛋白质的又一主要途径。绝大多数蛋白质都要先被泛素标记,进一步被多泛素化,而后被19S调节颗粒识别,再将其导入蛋白酶体降解[2-3]。2008年,Pearce等在结核分枝杆菌(Mycobacterium tuberculosis,Mtb)中发现了与真核细胞中的泛素功能相似的蛋白质,命名为原核类泛素蛋白(prokaryotic ubiquitin-like,Pup)[4]。结核分枝杆菌Pup与结核分枝杆菌蛋白酶体组成了结核分枝杆菌Pup-蛋白酶体系统(Pup-poroteasome system,PPS)。在PPS中,Pup可以在辅助因子的作用下标记多种功能蛋白,并介导被标记蛋白质通过蛋白酶体降解。在结核分枝杆菌中,Pup - 蛋白酶体系统有助于致病细菌宿主巨噬细胞内的持久性支持[5]。PPS的发现揭示了原核生物中一个崭新的蛋白质降解机制,对PPS降解蛋白质途径的作用机理和生理功能的研究已成为当前病原菌研究的热点。对PPS的研究有望找到更有效的抗结核药物作用的靶点。为此,本文对结核分枝杆菌Pup-蛋白酶体的研究进展做如下综述。
1.1Pup的结构特点 结核分枝杆菌中的Pup是一个由64个氨基酸组成的C-末端区域呈螺旋状的内部结构混乱的无序蛋白,可以对结核分枝杆菌待降解的蛋白质进行识别和修饰,然后将其导入结核分枝杆菌蛋白酶体进行降解[4]。Pup含有独特的区域与Pupulation酶(Pupulation enzymes)相互作用,并引发底物蛋白的蛋白酶体降解,其螺旋状C-末端介导其与底物蛋白质的连接,而其氨基末端则对于其降解功能的发挥至关重要[6]。虽然Pup与真核生物中各种泛素样蛋白质序列相比相似性很低,但它们的三维结构却高度保守,都呈现典型的类泛素折叠模式。尽管Pup与泛素在序列和对蛋白底物的靶向连接过程等方面存在一些差异,但两者在介导蛋白底物的蛋白酶体靶向降解方面所发挥的作用是相似的[7-8]。Pup是一种无序蛋白(inrrinsically disordered protein,IDP),其结构为不稳定的二级结构[9];Pup标记蛋白质后其N端仍保持无序状态,C端S21-K61形成螺旋结构,能与Mpa(mycobacterial proteasome ATPase)的N端螺旋结构域非共价作用,可被Mpa传递入蛋白酶体进行降解[10-11];因此Pup可能具有两种功能,它不仅是让底物成为蛋白酶体识别的标记物,而且使靶蛋白带上无序标签,有利于靶蛋白的降解[6]。
1.2蛋白酶体的结构特点 结核分枝杆菌的蛋白酶体为750 kDa,其结构与真核生物的蛋白酶体结构相似,呈桶状结构,包含由α亚基形成的2个7元外环和β亚基形成的2个7元内环。蛋白水解发生在β亚基N-末端的苏氨酸上。真核生物蛋白酶体含有7种α亚基和7种β亚基,其中只有3种β亚基(β1、β2、β5)具有蛋白水解活性。而原核生物蛋白酶体则通常只含有1种或2种类型的α和β亚基,其中结核分枝杆菌蛋白酶体的β亚基为单一的类型,并且14个β亚基中的每一个均提供1个N末端苏氨酸的活性位点[12]。冷冻电镜技术显示:结核分枝杆菌蛋白酶体的核心颗粒具有1个闭合的尾部,这个结果与负染色电镜技术所显示的密度测定结果是一致的。α-亚基N-末端八倍体的存在进一步提示结核分枝杆菌蛋白酶体含有1个门控式结构[13]。真核生物蛋白酶体的核心颗粒可通过7个α亚基的不同氨基末端肽关闭其蛋白底物的入口,而结核分枝杆菌蛋白酶体的晶体结构则提示其核心颗粒的门控是被7个相同的肽通过3种不同的构象紧紧密封的[3]。
Mtb中Pup-蛋白酶体系统介导的蛋白质降解过程与真核生物中的泛素化过程类似,Mtb中的Pup通过pupylation反应后使底物蛋白被标记上Pup并随之被蛋白酶体降解。pupylation过程类似于泛素化,但其酶学反应过程与泛素化过程不尽相同。近几年研究证明,利用结核杆分枝菌pupylation途径,可以帮助克服其宿主的免疫防御,使结核分枝杆菌在宿主内生存[14]。pupylation过程包括1个独立的脱酰胺作用和1个接合反应,分别通过Pup的去酰胺 (Dop)和Pup连接酶PafA来催化:Pup C端Gln在去酰胺酶Dop催化下形成Glu;在PafA 连接酶的作用下,通过水解ATP,使Pup C端Glu磷酸化,并催化其以共价键的形式与底物蛋白上的Lys连接;Pup标记的蛋白质通过Pup C端与Mpa N端相互作用,Mpa水解ATP 打开蛋白酶体核心区域的门(α亚基),传递底物蛋白到蛋白酶体的核心区域,同时Dop促使去Pup化,使Pup重复利用;底物经由蛋白酶体被降解。
在真核生物当中,泛素所介导的蛋白质降解需要泛素活化酶E1,泛素偶联酶E2,特异性识别蛋白底物的泛素连接酶E3,ATP酶及许多调节亚基等一系列辅助因子来参与调节,这些辅助因子参与靶蛋白的泛素化和去泛素化过程,来调控细胞内蛋白质的降解。原核生物中Pup-蛋白酶体系统介导的蛋白质降解也需要辅助因子,目前已知的辅助因子有Mpa(mycobacterial proteasome ATPase)、 Dop (deamidase of Pup) 和PafA (proteasome accessory factor A)。在对NO 敏感的结核分枝杆菌的研究过程中发现,多个与蛋白酶体相关的基因突变后会导致结核分枝杆菌对NO敏感,导致结核分枝杆菌存活率显著降低,这说明蛋白酶体的相关基因在结核分枝杆菌的致病过程中发挥着极其重要的作用[13]。
Mpa:1998年,Wolf 等发现,放线菌中蛋白酶体基因的上游基因Rv2115c 可编码具有ATP 水解功能的蛋白质[15];与真核生物中蛋白酶体19S 调节颗粒中的ATP 酶具有同源性,且两者的功能相似,即参与调节蛋白酶体α亚基“门”的开关;同时,Mpa 自身是原核蛋白酶体的底物,表明原核蛋白酶体可以通过对Mpa 的降解进行自我功能的反馈调节,结核分枝杆菌蛋白酶体功能与此相似。研究表明,当Mpa基因缺失或突变时,蛋白酶体对结核分枝杆菌的保护能力大大降低,而且结核分枝杆菌菌株的毒力也减弱了[16-17];导致结核分枝杆菌在体内和体外的生长速率减慢,结核分枝杆菌在体内的杀伤力减弱[18]。
连接酶PafA:由结核分枝杆菌 Rv2097c 基因编码,与γ-谷氨酰半胱氨酸具有同源性,是一个依赖于ATP的羧氨连接酶。研究表明,PafA是蛋白酶体底物保持稳定水平的关键[19];当PafA基因突变或者是缺失时,可导致结核分枝杆菌蛋白酶体系统抗活性氮中间体(RNI)的能力减弱;而一氧化氮(NO)和其他活性氮中间体(RNI)的产生,有助于控制感染的结核分枝杆菌,而结核分枝杆菌蛋白酶体的辅助因子可保护结核分枝杆菌不受NO和RNI的损伤[20]。 Cerda-Maira和Festa等[19,21]发现,结核分枝杆菌PafA基因的突变可以造成底物蛋白的积累,同时检测不到Pup标记蛋白的存在,说明PafA对于Pup与靶蛋白连接是必需的,对于蛋白酶体降解底物蛋白过程中不可或缺的部分。
去酰胺酶Dop:Dop 蛋白由Rv2112c 基因编码,其氨基酸序列与真核生物蛋白酶体系统中的E1、E2 和E3 没有同源性,但与羧氨连接酶具有一定同源性[22]。Pup 蛋白C端序列为Gly-Gly-Gln,Dop的N端可以催化去酰胺化反应,将Pup C端的Gln转变为Glu。Imkamp等[23]通过敲除耻垢分枝杆菌(Mycobacterium smegmatis,Msm)菌株Dop基因构建了Dop缺失突变株,结果发现蛋白质的Pup化在Msm中不能进行,致使造成底物蛋白的大量积累。又将Dop基因重新植入Dop缺失突变株中,蛋白质的Pup化恢复正常,此研究表明Dop催化的去酰胺化反应对Pup与靶蛋白的共价连接是必需的。2010 年Burns和Imkamp等[24-25]发现,Dop不但具有蛋白质的Pup化功能,还具有去Pup化功能,在Dop的作用下被Pup标记的底物蛋白FabD、Ino1和PanB可以被去Pup化,产生游离的Pup,这一去Pup过程依赖于Mpa的存在。
由此证明,结核分枝杆菌蛋白酶体的辅助因子和结核分枝杆菌的致病性及在宿主细胞的持留有密切关系。
实验证实,在结核分枝杆菌中,能被Pup标记且被蛋白酶体降解的底物蛋白有FabD、PanB、Ino1、Icl、SodA、MtrA等,这些底物蛋白各自具有重要的生物学功能,同时与结核分枝杆菌的致病性和在宿主细胞的持留具有密切关系[8,26]。如丙二酰乙酰辅酶A转酰酶FabD在结核分枝杆菌内是催化脂肪酸合成的重要酶,而结核分枝杆菌的细胞壁含有大量脂肪酸,增加其对外界复杂环境的抵抗力,它和结核分枝杆菌逃逸免疫系统攻击的能力、结核分枝杆菌的毒力息息相关;与结核分枝杆菌的发病机制有密切关系[16,27]。酮脂酰羟甲基转移酶PanB参与结核分枝杆菌体内泛酸的生物合成,而泛酸与乙酰辅酶A的合成有关,乙酰辅酶A参与脂肪酸代谢和TCA循环[15,28]。磷酸肌醇合酶Ino1对结核分枝杆菌的硫醇和细胞壁脂聚糖的形成有重要作用,Movahedzadeh[29]等构建了缺乏基因编码Ino1的结核分枝杆菌突变体,结果显示结核分枝杆菌的Ino1突变体很难在巨噬细胞和小鼠体内长期生存。另一个重要的底物蛋白异柠檬酸裂解酶Icl,该酶是乙醛酸循环途径中的关键酶,它的催化作用是为在醋酸盐或含有某些脂肪酸的培养基上生长的结核分枝杆菌提供了碳源。正常体外培养条件下,Icl被降解,在体外缺氧条件下Icl的表达升高;Icl的缺失在感染急性期并不影响结核分枝杆菌的生长,但巨噬细胞的生存明显减弱,降低了结核分枝杆菌的持留能力和致病性[30-31]。过氧化物岐化酶SodA,高致病性的结核分枝杆菌中过氧化物岐化酶SodA的表达水平比非致病性的结核分枝杆菌高93倍[32];说明SodA与结核分枝杆菌的致病性密切相关,可能参与抗宿主免疫作用。结核分枝杆菌反应调节器MtrA紧密联系着细菌的清除,当结核分枝杆菌感染小鼠或巨噬细胞后,高表达的MtrA可以加速结核分枝杆菌的清除,但在体外培养基中高表达的MtrA不影响结核分枝杆菌菌株的正常生长[33]。由此说明,上述底物蛋白和结核分枝杆菌的致病性均有密切关系,蛋白酶体通过对这些蛋白的调控,使结核分枝杆菌能够在各种复杂的环境下维持其生理功能并致病。在不同的生长环境下Pup会选择性标记不同的蛋白,鉴于这些结核分枝杆菌Pup-蛋白酶体系统底物蛋白的生理功能,结核分枝杆菌Pup-蛋白酶体系统可以通过调控蛋白质降解在结核分枝杆菌的生长调控和致病性中发挥重要作用。
结核分枝杆菌的蛋白酶体是一些蛋白降解所必需的成分[9],对于在小鼠体内的持留[7]以及对体外氮氧化物压力下结核分枝杆菌的存活[34]都起到至关重要的作用。有研究证实蛋白酶体可作为新型药物的作用靶标[8];而近期研究发现了化合物oxathiazol-2-one和天然物质Fellutamide B,两者都具有抑制结核分枝杆菌蛋白酶体的功能。oxathiazol-2-one可以在不损伤细胞情况下有效的抑制结核分枝杆菌中蛋白酶体的功能,而且是不可逆的[35];在对oxathiazol-2-one的结构分析时发现该抑制剂是直接通过改变结核分枝杆菌蛋白酶体的蛋白水解酶活性位点来阻断其降解蛋白质功能的[36]。Fellutamide B是迄今为止最有力的结核分枝杆菌蛋白酶体抑制剂; 研究结果显示,Fellutamide B在不但可以抑制结核分枝杆菌20S,而且同时可以抑制蛋白酶体;结核分枝杆菌蛋白酶体络合时,Fellutamide B疏水尾部的部分的灵活性表明,尾部较短,可能会进一步提高其对结核分枝杆菌蛋白酶体功能的约束力[37]。如果蛋白酶体抑制剂发挥作用,蛋白酶体的功能受到限制,Pup标记的底物逐渐累积,导致基因表达的间接改变,将会大幅度减弱结核分枝杆菌抗外界的压力和其致病性的能力。最近研究证实,抑制剂可以有效对抗多种有毒力的广泛耐药的结核分枝杆菌临床分离株[38]。而且能穿透结核分枝杆菌并在硝化应激反应下杀死非复制的结核分枝杆菌[39]。这也进一步说明蛋白酶体抑制剂可以通过抑制蛋白酶体的功能来降低结核分枝杆菌的致病性。
迄今为止,对结核病的发病机制的研究尚处在探索阶段。结核病的防治仍面临着巨大的困难。结核分枝杆菌Pup-蛋白酶体系统与结核分枝杆菌的致病性密切相关,但对于结核分枝杆菌Pup-蛋白酶体系统的研究还处于初步阶段,仍需要大量的研究来进一步揭示结核分枝杆菌Pup-蛋白酶体系统在结核分枝杆菌致病过程中的作用和机制。Pup-蛋白酶体系统的研究为结核分枝杆菌致病机制的研究提供新的方向,对Pup标记的底物蛋白和蛋白酶体抑制剂的研究,都将有可能成为抗结核病的新的药物靶标。寻找新的更有效的抗结核药物作用靶点对于结核病尤其是耐药结核病的治疗已刻不容缓。深刻认识 Pup-蛋白酶体系统的调节机制为结核病的发病机制的研究提供了新的方向。
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