Keap1/Nrf2/ARE信号通路在中枢神经系统疾病中的研究进展

李珊珊，陈忠云，李 婧，徐志伟，杨 旭

氧化应激广泛参与神经系统的病理生理变化，脑缺血再灌注损伤是氧化应激的急性表现，慢性氧化应激亦是神经系统退行性疾病发生发展的重要原因。Keap1/Nrf2/ARE是迄今研究的最为重要的自身抗氧化应激通路。生理条件下，NF-E2相关因子2(NF-E2-related factor 2,Nrf2)在细胞质中与Kelch样ECH相关蛋白1(Kelch-like ECH-associated protein1,Keap1)结合，并通过Keap1蛋白将其锚定于由肌动蛋白构成的细胞骨架上，从而无法进入细胞核发挥转录活性；当受到亲电试剂、活性氧簇(reactive oxygen species,ROS)的刺激时，Keap1与Nrf2解偶联使得Nrf2转移入核，与基因中的Maf蛋白结合成异二聚体后识别抗氧化反应元件(antioxident response element,ARE)，启动下游Ⅱ相解毒酶、抗氧化蛋白类、泛素酶以及蛋白酶体的基因表达，提高细胞抗氧化应激能力。调控Keap1/Nrf2/ARE信号通路从而调控其下游基因的表达，可能成为预防和治疗氧化应激所致的中枢神经系统疾病的重要方法。因此本文对Keap1/Nrf2/ARE信号通路在中枢神经系统疾病的作用作一综述。

1 脑血管疾病

1.1 缺血性卒中(ischemic stroke,IS) IS是指各种原因所致的局部脑组织区域血液供应障碍，导致脑组织缺血缺氧性变性坏死，是脑卒中的最常见类型。兴奋性毒性、氧化应激、炎性反应以及线粒体功能障碍等病理过程参与IS的发生发展[1]，其中氧化应激作为脑卒中最为重要的损伤机制可以作为治疗的潜在靶点。Nrf2是内源性抗氧化应激的核转录因子，上调其表达后可以增加Ⅱ相解毒酶和抗氧化酶的表达，对脑卒中起到保护作用。Tanaka 等[2]研究发现，大鼠大脑中动脉阻断(MCAO)后再灌注，2 h后Nrf2表达增加并在8 h达到高峰；其下游抗氧化蛋白谷胱甘肽(glutathione,GSH)以及血红素加氧酶1(HO-1)在24～72 h梗死区域的表达亦显著升高。大鼠MCAO模型中，侧脑室或者腹腔内注射Nrf2激动剂叔丁基对苯二酚(TBHQ)均可以降低运动、感觉功能和缺血后的梗死面积[3-4]。与此项研究类似，Nrf2敲除小鼠MCAO后90 min进行再灌注，其神经功能缺损恶化并伴有梗死面积增加[5]。此外，Nrf2基因敲除小鼠的永久性MCAO模型中，其损伤后7 d的恢复情况亦显著降低[3]。

活化Nrf2信号通路可以清除ROS，对IS损伤后具有神经保护作用。Nrf2-/-小鼠脑损伤后可以产生更多的ROS[6]。为了明确Nrf2的抗氧化效果依赖于哪种细胞类型，Shih等[7]通过基于Nrf2过表达载体的腺病毒转染的神经元和神经胶质细胞共培养，得出星形胶质细胞过表达Nrf2后，比神经元细胞具有更强的抗氧化性能，其潜在机制可能是Nrf2过表达后星形胶质细胞释放出更多的GSH，从而保护神经细胞免受过氧化氢(H2O2)的氧化作用。然而，另一项研究表明Nrf2-/-小鼠中性粒细胞释放ROS，很可能是由于Nrf2可以上调GSH氧化还原体系同时抑制炎性递质的产生[8]。TBHQ不仅可以保护原代培养的神经元细胞免受氧自由基的作用，同时可以保护细胞免受N-甲基-M-天冬氨酸(NMDA)或者谷氨酸盐的兴奋性毒性作用[5]，因此，可以假设Nrf2参与调节谷氨酸盐转运体或者受体的表达。

1.2 脑出血(intracerebral hemorrhage,ICH) ICH是指原发性非创伤性脑实质内出血，占急性脑血管病的20%～30%，亦是急性脑血管疾病中病死率最高的疾病。长期的高血压使脑细动脉、小动脉发生玻璃样变和纤维素样坏死，管壁弹性减弱，血压骤然升高时血管易破裂出血。出血后血肿形成，并伴有血肿周围脑组织水肿，引起颅内压升高，使脑组织受压移位后发生脑疝，脑疝是导致患者死亡的直接原因。随后产生的脑缺血和氧化应激进一步加重ICH后脑损伤。Chen等[9]研究表明ICH后Nrf2信号通路被激活，同时伴有HO-1表达的增加，ICH后24 h HO-1表达上调，5 d时出现高峰，第8天时消退。HO-1主要在小胶质细胞和血管内皮细胞、星形胶质细胞中度表达以及神经元细胞少量表达。Zhao等[6]和Wang等[8]、Chen等[9]分别表明Nrf2-/-小鼠在ICH后神经功能缺损和出血后损伤更为严重，提示Nrf2对于ICH后神经保护具有重要作用。基于此研究Zhao等[6]通过腹腔注射Nrf2激动剂莱菔硫烷观察到激活Nrf2信号通路对ICH具有保护作用，可以减少氧化应激、脑水肿及炎症的产生；Sun等[10]通过姜黄素也验证了这些作用。虽然以上研究均验证了激活Nrf2信号通路的保护作用，但是其下游酶的表达并没有阐述。

1.3 蛛网膜下腔出血(subarachnoid hemorrhage,SAH) SAH是指有血液流入蛛网膜下腔，分为原发性和继发性。其主要病因是颅内动脉瘤和脑血管畸形，病变血管可自发破裂，或者因为血压突然增高导致血管破裂，血液进入蛛网膜下腔，通过围绕在脑和脊髓周围的脑脊液迅速播散，刺激脑膜引起脑膜刺激征，同时颅内容量的增加引起颅内压增高，甚至是脑疝。Wang等[11]在实验性SAH大鼠基底动脉的内皮细胞和血管平滑肌细胞上均检测到Nrf2被激活，表现为Nrf2在细胞核内表达增加以及与ARE结合。亦有研究发现在SAH的大脑动脉[12]、小胶质细胞以及星形胶质细胞[13]中HO-1表达上调。激活Nrf2信号通路对SAH亦起到保护作用。姜黄素可以减少小鼠ICH后血管炎症和痉挛[14]，并同时降低小鼠的氧化应激和死亡[15]。莱菔硫烷同样可以活化Nrf2信号通路，上调其下游HO-1以及醌氧化还原酶1(NQO-1)等酶的表达，同时减少皮质细胞的凋亡、脑水肿以及血-脑脊液屏障的损伤[16]。除了这些经典的Nrf2激动剂，已有报道称促红细胞生成素[17]和褪黑素[18]同样可以活化Nrf2信号通路，对SAH后脑损伤起到保护作用；促红细胞生成素和褪黑素可以上调HO-1和NQO-1等Ⅱ相解毒酶的产生，减少大脑皮质细胞凋亡并保护血-脑脊液屏障。HO-1的表达上调对SAH起到保护作用，可以衰减SAH的血管痉挛。

2 神经系统退行性疾病

2.1 帕金森病(parkinson disease,PD) PD是一种无法治愈的运动障碍性疾病，其特征性病理改变为黑质致密部黑质多巴胺能神经元大量变性丢失，残留的神经元胞质内有Lewy小体形成。5例PD患者尸检数据表明在黑质神经元的细胞核中存在Nrf2的高表达[19]。这一现象与卒中氧化应激的保护作用相一致，PD患者神经元细胞核中Nrf2的表达上调很可能是对抗氧化毒性反应的一种代偿性表现，从而增强机体的抗氧化防御系统。而氧化应激一直是PD发病机制的研究热点。

PD中Nrf2的保护作用通过临床上应用B型单胺氧化酶抑制剂——丙炔苯丙胺(司来吉兰)得到证实。最近研究显示丙炔苯丙胺的作用依赖于其对Nrf2的激活[20]。Nrf2也可能参与了DJ-1/PARK7基因的神经保护作用，这种基因在1%～2%的早期家族性PD患者中发现。DJ-1通过抑制Nrf2与Keap1的结合从而降低Nrf2的泛素化。此外，在DJ-1基因敲除的小鼠中TBHQ不能持续诱导Nrf2的核转位[21-22]。DJ-1基因缺陷的患者表现为Nrf2下游基因表达的减少并且易受氧化应激的影响[23-24]。因此，与DJ-1基因突变相关的早期家族性PD的发病机制可能与Nrf2相关。Chen等[25]发现只有Nrf2表达的星形胶质细胞能够减少1-甲基-4-苯基-1,2,3,6-四氢吡啶(MPTP)的神经毒性,再次验证了星形胶质细胞的Nrf2对PD模型的神经保护起主要作用。此外，TBHQ诱导的大部分基因的保护作用主要发生在星形胶质细胞中[26]，星形胶质细胞再通过GSH间接支持神经元的活动。

2.2 阿尔茨海默病(Alzheimer disease,AD) AD是老年人常见的神经系统变性病，病理学上表现为老年斑、神经元纤维缠结、颗粒空泡变性、广泛神经元缺失及轴索和突触异常、星形胶质细胞反应、小胶质细胞反应和血管淀粉样变。研究发现在海马神经元内AD患者细胞核内Nrf2的表达明显减少[19]。此外在APP/PS1转基因小鼠上亦显示Nrf2/ARE的下游蛋白减少[27]。由于氧化应激是AD发病机制中必不可少的因素，氧化应激激活Nrf2信号通路，故而对于Nrf2核转位减少以及Ⅱ相解毒酶表达的减少能否参与AD的病理改变及神经元的死亡十分必要。

最近研究表明了Nrf2/ARE信号通路在AD模型中的作用及其潜在的治疗价值。通过TBHQ诱导Nrf2的活性增加或通过腺病毒介导的基因传递引起的Nrf2过表达均保护了Aβ1-42诱导的体外培养海马神经元的死亡[27]。在体实验通过传递慢病毒编码的人类双边Nrf2基因到APP/PS1小鼠的海马中，可以缓解小鼠的空间学习能力障碍，并明显减少星形胶质细胞的浸润。另一项研究表明，给予Aβ注射的大鼠TBHQ可以减少Aβ的沉积及其诱导的细胞凋亡[28]。这些研究表明激活Nrf2信号通路对AD模型的保护作用。

2.3 肌萎缩侧索硬化症(amyotrophic lateral sclerosis,ALS) ALS是运动神经元病中最为常见和最易识别的表型，是一种病因未明的选择性侵犯脊髓前角细胞、脑干后组运动神经元、皮质锥体束细胞及锥体束的慢性进行性神经变性疾病，表现为上、下运动神经元同时受损。流行病学研究表明，90%～95%的为散发性ALS，家族性ALS占5%～10%。其中铜/锌超氧化物歧化酶(SOD1)基因突变与之有关已被公认，在散发性病例中占1%～4%、家族遗传性病例中约20%存在该基因的突变。SOD1-G93A转基因小鼠是ALS最为常用的模型[29]。

Pehar等[30]在SOD1-G93A转基因小鼠上发现Nrf2及GSH相关酶的生物合成均减少。同样，通过微阵列分析技术显示，具有SOD1突变体的NSC34细胞的Nrf2转录基因同样被抑制[31]。在5例ALS患者的尸检中，发现大脑初级运动皮层区和脊髓内的Nrf2蛋白和mRNA水平均降低。此外，ALS患者的运动皮层区Keap1的mRNA增高，但是在蛋白水平没有得到验证[32]。新近研究表明，SOD1突变的星形胶质细胞对周围的运动神经元具有ALS毒性作用，而在胶质酸性蛋白诱导下的星形胶质细胞Nrf2过表达则可以逆转这种毒性，提高小鼠的生存时间[33]。这一结果表明，星形胶质细胞中的Nrf2的激活对神经元具有保护作用。

3 展望

Nrf2作为抗氧化应激的重要调节因子，已经成为中枢神经系统疾病的研究热点。众多研究已经表明，Nrf2在中枢神经系统疾病中具有保护作用，但其机制有待进一步探讨研究。目前的研究已经表明，Nrf2激动剂莱菔硫烷和TBHQ对中枢神经系统具有保护作用，但是仍然需要寻找对人体更为安全有效且能顺利通过血-脑脊液屏障的药物。

综上所述，Keap1/Nrf2/ARE信号通路可以作为治疗中枢神经系统疾病的一个新的靶点，对中枢神经系统疾病的治疗发挥重要作用。

1 Lo EH,Dalkara Y,Moskowitz MA.Mechanisms,challenges and opportunities in stroke[J].Nat Rev Neurosci,2003,4(5):399-415.

2 Tanaka N,Ikeda Y,Ohta Y,et al.Expression of Keap1-Nrf2 system and antioxidative proteins in mouse brain after transient middle cerebral artery occlusion[J].Brain Res,2011,1370:246-253.

3 Shih AY,Li P,Murphy TH.A small-molecule-inducible Nrf2-mediated antioxidant response provides effective prophylaxis against cerebral ischemia in vivo[J].J Neurosci,2005,25(44):10321-10335.

4 Zhang F,Wang S,Zhang M,et al.Pharmacological induction of heme oxygenase-1 by a triterpenoid protects neurons against ischemic injury[J].Stroke,2012,43(5):1390-1397.

5 Shah ZA,Li RC,Thimmulappa RK,et al.Role of reactive oxygen species in modulation of Nrf2 following ischemic reperfusion injury[J].Neuroscience,2007,147(1):53-59.

6 Zhao X,Sun G,Zhang J,et al.Transcription factor Nrf2 protects the brain from damage produced by intracerebral hemorrhage[J].Stroke,2007,38(12):3280-3286.

7 Shih AY,Johnson DA,Wong G,et al.Coordinate regulation of glutathione biosynthesis and release by Nrf2-expressing glia potently protects neurons from oxidative stress[J].J Neurosci,2003,23(8):3394-3406.

8 Wang J,Fields J,Zhao C,et al.Role of Nrf2 in protection against intracerebral hemorrhage injury in mice[J].Free Radic Biol Med,2007,43(3):408-414.

9 Chen M,Regan RF.Time course of increased heme oxygenase activity and expression after experimental intracerebral hemorrhage:correlation with oxidative injury[J].J Neurochem,2007,103(5):2015-2021.

10 Sun KH,Chang KH,Clawson S,et al.Glutathione-S-transferase P1 is a critical regulator of Cdk5 kinase activity[J].J Neurochem,2011,118(5):902-914.

11 Wang Z,Chen G,Zhu WW,et al.Activation of nuclear factor-erythroid 2-related factor 2(Nrf2) in the basilar artery after subarachnoid hemorrhage in rats[J].Ann Clin Lab Sci,2010,40(3):233-239.

12 Ono S,Zhang ZD,Marton LS,et al.Heme oxygenase-1 and ferritin are increased in cerebral arteries after subarachnoid hemorrhage in monkeys[J].J Cereb Blood Flow Metab,2000,20(7):1066-1076.

13 Matz P,Turner C,Weinstein PR,et al.Heme-oxygenase-1 induction in glia throughout rat brain following experimental subarachnoid hemorrhage[J].Brain Res,1996,713(1/2):211-222.

14 Wakade C,King MD,Laird MD,et al.Curcumin attenuates vascular inflammation and cerebral vasospasm after subarachnoid hemorrhage in mice[J].Antioxid Redox Signal,2009,11(1):35-45.

15 Kuo CP,Lu CH,Wen LL,et al.Neuroprotective effect of curcumin in an experimental rat model of subarachnoid hemorrhage[J].Anesthesiology,2011,115(6):1229-1238.

16 Chen G,Fang Q,Zhang J,et al.Role of the Nrf2-ARE pathway in early brain injury after experimental subarachnoid hemorrhage[J].J Neurosci Res,2011,89(4):515-523.

17 Zhang J,Zhu Y,Zhou D,et al.Recombinant human erythropoietin(rhEPO) alleviates early brain injury following subarachnoid hemorrhage in rats:possible involvement of Nrf2-ARE pathway[J].Cytokine,2010,52(3):252-257.

18 Wang Z,Ma C,Meng CJ,et al.Melatonin activates the Nrf2-ARE pathway when it protects against early brain injury in a subarachnoid hemorrhage model[J].J Pineal Res,2012,53(2):129-137.

19 Ramsey CP,Glass CA,Montgomery MB,et al.Expression of Nrf2 in neurodegenerative diseases[J].J Neuropathol Exp Neurol,2007,66(1):75-85.

20 Xiao H,Lv F,Xu W,et al.Deprenyl prevents MPP(+)-induced oxidative damage in PC12 cells by the upregulation of Nrf2-mediated NQO1 expression through the activation of PI3K/Akt and Erk[J].Toxicology,2011,290(2/3):286-294.

21 Clements CM,McNally RS,Conti BJ,et al.DJ-1,a cancer- and Parkinson′s disease-associated protein,stabilizes the antioxidant transcriptional master regulator Nrf2[J].Proc Natl Acad Sci U S A,2006,103(41):15091-15096.

22 Gan L,Johnson DA,Johnson JA.Keap1-Nrf2 activation in the presence and absence of DJ-1[J].Eur J Neurosci,2010,31(6):967-977.

23 Mosser DM,Edwards JP.Exploring the full spectrum of macrophage activation[J].Nat Rev Immunol,2008,8(12):958-969.

24 Zhou W,Freed CR.DJ-1 up-regulates glutathione synthesis during oxidative stress and inhibits A53T alpha-synuclein toxicity[J].J Biol Chem,2005,280(52):43150-43158.

25 Chen PC,Vargas MR,Pani AK,et al.Nrf2-mediated neuroprotection in the MPTP mouse model of Parkinson′s disease:Critical role for the astrocyte[J].Proc Natl Acad Sci U S A,2009,106(8):2933-2938.

26 Kraft AD,Johnson DA,Johnson JA.Nuclear factor E2-related factor 2-dependent antioxidant response element activation by tert-butylhydroquinone and sulforaphane occurring preferentially in astrocytes conditions neurons against oxidative insult[J].J Neurosci,2004,24(5):1101-1112.

27 Kanninen K,Malm TM,Jyrkkanen HK,et al.Nuclear factor erythroid 2-related factor 2 protects against beta amyloid[J].Mol Cell Neurosci,2008,39(3):302-313.

28 Nouhi F,Tusi SK,Abdi A,et al.Dietary supplementation with tBHQ,an Nrf2 stabilizer molecule,confers neuroprotection against apoptosis in amyloid beta-injected rat[J].Neurochem Res，2011,36(5):870-878.

29 Gurney ME,Pu H,Chiu AY,et al.Motor neuron degeneration in mice that express a human Cu,Zn superoxide dismutase mutation[J].Science，1994,264(5166):1772-1775.

30 Pehar M,Vargas MR,Robinson KM,et al.Mitochondrial superoxide production and nuclear factor erythroid 2-related factor 2 activation in p75 neurotrophin receptor-induced motor neuron apoptosis[J].J Neurosci,2007,27(29):7777-7785.

31 Kirby J,Halligan E,Baptista MJ,et al.Mutant SOD1 alters the motor neuronal transcriptome:implications for familial ALS[J].Brain,2005,128(Pt 7):1686-1706.

32 Sarlette A,Krampfl K,Grothe C,et al.Nuclear erythroid 2-related factor 2-antioxidative response element signaling pathway in motor cortex and spinal cord in amyotrophic lateral sclerosis[J].J Neuropathol Exp Neurol,2008,67(11):1055-1062.

33 Vargas MR,Johnson DA,Sirkis DW,et al.Nrf2 activation in astrocytes protects against neurodegeneration in mouse models of familial amyotrophic lateral sclerosis[J].J Neurosci,2008,28(50):13574-13581.