内皮型一氧化氮合酶脱偶联在心血管疾病中的致病作用*

赵艳霞综述，格日力审校

内皮型一氧化氮合酶脱偶联在心血管疾病中的致病作用*

赵艳霞综述，格日力审校

二聚体结构的内皮型一氧化氮合酶（eNOS）氧化L-精氨酸生成一氧化氮（NO），后者对心血管系统具有保护作用。血管内氧化还原反应失衡导致eNOS脱偶联，脱偶联的eNOS产生超氧化物而非NO，导致内皮功能损伤，进而引起多种心血管疾病的发生和进展。深入了解eNOS脱偶联与心血管疾病的关系，对预防和治疗心血管疾病具有重要意义。

内皮型一氧化氮合酶；脱偶联；心血管疾病；一氧化氮

目前已发现的一氧化氮合酶（NOS）有三种同工酶，分别是神经型NOS（nNOS或NOS-I）、诱导型NOS（iNOS或NOS-Ⅱ）和内皮型NOS(eNOS或NOS-Ⅲ）。内皮型一氧化氮合酶（eNOS）主要表达于血管内皮细胞，在心肌细胞、气道上皮细胞、肾脏管状细胞和其他器官也有表达[1]。心血管系统的正常功能有赖于eNOS的保护。eNOS催化L-精氨酸产生一氧化氮（NO），NO通过扩张血管、抑制血小板聚集、抑制平滑肌细胞增殖、减少白细胞粘附实现维持血管稳态、调节血压、抗炎及预防动脉粥样硬化的作用[2]。血管内氧化还原反应失衡导致eNOS脱偶联，脱偶联的eNOS产生超氧化物（O2-）而非NO，导致内皮功能损伤，进而引起多种心血管疾病的发生和发展。深入了解eNOS脱偶联与心血管疾病的关系，对预防和治疗心血管疾病具有重要意义。

1 内皮型一氧化氮合酶分子结构和功能调节

eNOS是一种结合辅因子的同源二聚体，这种结构是其催化L-精氨酸和活性氧（O2）产生L-瓜氨酸和NO所必需的。每个eNOS亚基有两个结构区，即氧化区和还原区。N-端为氧化区，含有四氢生物蝶呤（BH4）、L-精氨酸和血红素的结合位点。连接eNOS两个亚基的是锌指结构，由锌离子（Zn2+）和每个亚基的两个半胱氨酸残基构成。C-端为还原区，含有与黄素腺嘌呤二核苷酸（FAD）、黄素单核苷酸（FMN）和烟酰胺腺嘌呤二核苷酸（NADPH）结合的位点。每个亚基氧化NADPH为NADP+产生电子，电子被传递到氧化区的血红素[3]。氧化区和还原区的连接处为钙调蛋白（CaM）结合的区域，当结合两分子的CaM时，激活eNOS，将电子的传递给L-精氨酸，生成NO。

翻译后经十四烷酰化和棕榈酰化修饰的eNOS与小窝蛋白-1（Caveolin-1）结合，使得eNOS定位于质膜小窝，即质膜的凹陷处，此时eNOS处于失活状态。刺激因素通过Ca2+激活CaM并与eNOS结合，促使eNOS从Caveolin-1上解离并从小窝转位到胞浆，转位后的eNOS功能上调。eNOS不同氨基酸位点的磷酸化作用不同。磷酸化丝氨酸（Ser）1177是改变酶对Ca2+敏感性及产生过氧化物和NO比例的关键位点，磷酸腺苷活化蛋白激酶（AMPK）直接磷酸化Ser1177可增强热休克蛋白90（HSP90）与eNOS的结合，进而提高eNOS的活性，促进NO的产生。磷酸化CaM结合区域的苏氨酸（Thr）495位点，通过抑制CaM与eNOS结合而抑制eNOS的激活。另外，磷酸化FMN结合区域的Ser633位点可以增加Ser1177磷酸化及Ca2+激活的eNOS的活性。磷酸化Ser114和Ser615的功能尚存在争议[3]。

BH4和L-精氨酸是eNOS重要的辅因子，BH4能保持血红素结合位点功能正常；增加eNOS与L-精氨酸结合力；稳定eNOS二聚体的结构与活性。另外，BH4具有较强还原性，可清除活性氧（ROS）和过氧化亚硝基[4]。锌指结构也能够保证BH4结合位点的完整性，另外，小窝内的L-瓜氨酸可以转变为L-精氨酸循环再利用，以保证eNOS底物的充足，并稳定其二聚体结构[5]。

2 脱偶联的内皮型一氧化氮合酶

eNOS脱偶联是指在各种因素作用下，eNOS的四级结构发生改变，由两个亚基偶联的同源二聚体结构变为一个亚基的单体结构。通过SDS聚丙烯酰胺凝胶电泳可见eNOS二聚体减少，单体与二聚体的比值增加[6]。脱偶联的eNOS产生O2-而不是NO，以产生的O2-为中心会使损伤效应不断放大，O2-氧化NO为氧化性更强的过氧亚硝基（ONOO-），进而氧化eNOS的辅因子使其数量减少或功能障碍，导致更多的eNOS脱偶联，产生更多的O2-，降低NO的生成和生物利用度，损伤血管内皮，进而引起心血管疾病的发生和进展。eNOS脱偶联的因素主要包括BH4或L-精氨酸含量不足，锌指结构破坏，氧化应激损伤。其中氧化应激损伤与eNOS脱偶联的关系结合在以下几点中叙述。

2.1四氢生物蝶呤与内皮型一氧化氮合酶脱偶联

BH4是稳定eNOS活性的重要辅因子。BH4合成方式有两种，即从头合成和补救合成。从头合成是以三磷酸鸟苷（GTP）为原料，在鸟苷三磷酸环化水解酶1（GTPCH1）和墨蝶呤还原酶（SR）的作用下合成BH4。GTPCH1是该反应中的限速酶，因为BH4合成的调节通过改变转录水平来实现，所以BH4的合成很大程度依赖于GTPCH1的表达。某些炎性因子可以增加转录水平，比如肿瘤坏死因子-α（TNF-α）、白介素-1（IL-1）、干扰素-γ及脂多糖（LPS）。GTPCH1连同Caveolin-1与eNOS定位在细胞小窝，它能连续的提供BH4。在哺乳动物中，补救合成主要通过二氢叶酸还原酶(DHFR)和二氢生物蝶呤还原酶(DHPR)实现。DHFR主要激活叶酸为5-甲基四氢叶酸，同时可以将BH2还原为BH4。DHPR可以将醌式BH2还原为

BH4不足时，eNOS脱偶联，因而失去正常产生NO的能力而产生超氧化物。产生的超氧化物会氧化剩余的BH4为BH2，导致血管中BH4含量减少，而BH2含量增多，BH2又是BH4的拮抗剂，这将会增加eNOS脱偶联，进一步增多活性氧（ROS）的产生和NO的减少。同时，超氧化物会与生成的NO反应，生成ONOO-[7]。另外，增加酶的活性，比如NADPH氧化酶、黄嘌呤氧化酶等的活性增加会触发超氧化物自由基生成的级联反应，其中连续生成的过氧硝酸基ONOO-氧化BH4为BH3，增加eNOS脱偶联，进而产生更多的自由基。过氧亚硝酸基会不可逆的使其他蛋白的酪氨酸残基硝化，使其磷酸化受损及酶的功能紊乱[8]。

若只增加eNOS的表达而没有平行的增加BH4，即相对的BH4不足，会因辅因子与酶的比例失衡而导致eNOS脱偶联[9]。所以保持eNOS与BH4的比例平衡对于脱偶联很重要，有研究表明降低BH4水平可激活核转录因子-E2-相关因子，降低人内皮细胞eNOS蛋白水平，故保持eNOS与BH4的比例平衡，使eNOS处于偶联状态，因而降低了ROS的生成[10]。在保持eNOS/BH4比值恒定的情况下，增加细胞内BH2浓度将明显的增加eNOS依赖的超氧化物的生成，因此，eNOS脱偶联不单纯取决于eNOS/BH4比值，还与细胞内BH4/BH2比值有关系。Crabtree等[11]研究显示鼠科动物内皮细胞中含有大量的DHFR，若用甲氨蝶呤降低该酶的活性，或基因敲除DHFR，导致BH4氧化为BH2，继而eNOS脱偶联。DHFR可将BH2还原再生为BH4，如此保持较好的BH4/BH2比值来稳定eNOS的偶联状态，尤其在BH4和BH2较少的情况下。

2.2L-精氨酸与内皮型一氧化氮合酶脱偶联

L-精氨酸在保持eNOS偶联中的必要作用尚存在争议。因为血浆L-精氨酸浓度是在体激活eNOS所需浓度的30倍[11]。另外，L-精氨酸自身可以被细胞循环再利用。精氨酸酶增加细胞内L-精氨酸的分解，引起局限的、亚细胞的L-精氨酸含量降低。因此，内皮细胞表达的精氨酸酶可与eNOS竞争其底物，降低eNOS的作用。eNOS的抑制剂非对称性二甲基精氨酸（ADMA）直接抑制eNOS，同时也抑制内皮细胞摄取L-精氨酸。因此，降低L-精氨酸与ADMA比值可降低eNOS产生的NO。有研究显示，在人动脉和静脉中，血清ADMA水平与eNOS偶联水平呈明显的负相关。此外，增加血浆ADMA浓度与血管氧化压力及内皮功能失调的发生有关[12,13]。如此，改变ADMA而不是L-精氨酸可触发eNOS脱偶联。而另有研究表明在BH4不足时，ADMA可使eNOS脱偶联，增加ROS产生，但是在L-精氨酸充足时不会出现这样的结果[14]。ADMA升高与L-精氨酸不足均可使eNOS脱偶联而增加ROS的产生，所以在生理情况下，ADMA可能与eNOS脱偶联无关。

2.3锌指结构与内皮型一氧化氮合酶脱偶联

锌指结构由一个Zn2+与来自eNOS每个亚基的两个半胱氨酸残基构成，位于eNOS的氧化区，等距于每个亚基的血红素，能保持BH4结合位点的完整性。锌指结构突变会阻止Zn2+、BH4、L-精氨酸的结合，使eNOS失活，提示锌指结构稳定二聚体对酶的活化非常重要。用过氧亚硝基处理分离的eNOS，过度产生的NO和O2-相互反应，氧化锌指结构，导致eNOS脱偶联。Chen等[7]认为BH4稳定二聚体不需要Zn的参与，因为尽管过氧亚硝基处理失去Zn2+的结合，降低eNOS的活性，但是用Zn的螯合物孵化并未改变eNOS的活性。

3 内皮型一氧化氮合酶脱偶联对心血管系统的影响

高血压与心力衰竭：eNOS基因表达影响小鼠的血管张力，因此成为血压调节的重要因素，eNOS基因缺失引起高血压，而eNOS基因过表达则降低血压。高血压大鼠存在eNOS脱偶联，逆转eNOS脱偶联为二聚体的eNOS，可增加大鼠主动脉NO生物活性，降低自发性高血压大鼠的血压[15]。对于高血压患者，少量连续口服BH4制剂可降低收缩压、平均动脉压，改善内皮功能和氧化压力[16]。另有研究证实eNOS脱偶联在压力超负荷诱导的心室重构模型中起关键作用，eNOS脱偶联可引起心肌肥厚和纤维化，降低心肌收缩力，引起心力衰竭。经口给予BH4可抑制eNOS脱偶联，增加NO产生，并减少ROS的产生，可预防或逆转心室肥厚、纤维化，改善心功能[17]。需要解释的是因为eNOS-/-小鼠没有eNOS，也就没有脱偶联的eNOS及其依赖的超氧化物产生，所以eNOS-/-小鼠在压力超负荷情况下心肌肥厚、扩张和纤维化均较轻[18]。

糖尿病：eNOS脱偶联与糖尿病的关系密切，既往实验研究有一矛盾的现象，即在链脲霉素诱导糖尿病模型动物血管eNOS的mRNA及蛋白表达是上调的，而NO没有相应的增加，且同时存在内皮功能障碍。在糖尿病模型动物中eNOS脱偶联的发现可以合理解释这一矛盾。高血糖可增加O2

-的产生，进而增加ADMA的生成，ADMA抑制L-精氨酸的作用，导致eNOS脱偶联，NO生成减少，超氧化物生成增多，增加血管氧化压力，降低NO的生物利用，导致糖尿病血管内皮功能失调[19]。另外糖尿病增加的氧化压力也可过多的氧化BH4为BH2，使 BH4缺乏，引起eNOS脱偶联，血管修复能力降低，进而加重糖尿病内皮损伤，补充BH4可改善内皮依赖性血管舒张障碍[20]，或补充叶酸刺激DHFR增加BH2的还原，逆转eNOS脱偶联，近而预防糖尿病心脏功能失调[21]。动物实验证明BH4不足还可能与内皮GTPCH1表达下调及降解加速有关，在链脲霉素诱导的2型糖尿病模型小鼠中，AMPK的减少导致26S蛋白酶体的活性异常，引起GTPCH的降解加速。临床治疗糖尿病常用药物二甲双胍即是通过上调AMPK来抑制26S蛋白酶体对GTPCH的降解保持eNOS活性，从而改善血管功能，降低2型糖尿病患者的死亡率[22]。

动脉粥样硬化：eNOS脱偶联是动脉粥样硬化（AS）的重要机制之一。eNOS脱偶联降低NO的产生，减少其对血管的保护作用，既往实验证明eNOS基因敲除或使用其抑制剂可加速实验动物AS的形成；另外eNOS脱偶联生产超氧化物，增加氧化压力，促进AS的形成。用低密度脂蛋白（LDL）孵育内皮细胞或在体高脂血症，可直接增加内皮细胞氧化压力，也可激活内皮的血管紧张素Ⅱ，后者提高NADPH氧化酶表达，二者均可引起BH4氧化，也减少DHFR对BH4的循环利用，导致eNOS脱偶联，使得NO产生减少，氧化压力增加，损伤血管内皮，促进AS的形成与进展[23]。Antoniades等[24]用冠状动脉疾病（CAD）患者做搭桥手术的大隐静脉和肠系膜动脉研究，发现血浆生物喋呤水平与血管的生物喋呤水平呈负相关；血管BH4与血管ROS呈负相关，与eNOS偶联及NO调节的血管功能呈正相关；血浆BH4同样与血管损伤程度和C反应蛋白（CRP）水平正相关，外源性补充BH4可改善高胆固醇血症兔的内皮功能紊乱[25]。另外，促炎因子和GTPCH1单体的特异性也与eNOS脱偶联有关。促炎因子可明显的增加血浆生物喋呤的水平，却不能增加内皮中生物喋呤的水平，使eNOS脱偶联，引起内皮功能失调。患者特异的GTPCH1单体决定血浆及血管中BH4的水平，GTPCH1单体被3个单核苷酸多态性位点决定，启动子区域的rs8007267G/A，内含子1的rs3783641A/T和3′端非翻译区的rs10483639C/G。特异的GTPCH1单体与eNOS脱偶联，增加血管超氧化物生成及降低内皮功能有关，是AS独立的影响因素[26]。

缺血性心脏病：氧化压力在心肌梗死（MI）后心肌重塑的细胞水平上起关键作用。既往研究提示，在转基因小鼠中，eNOS过表达的小鼠，MI后心肌重塑的程度减轻，而eNOS-/-小鼠则重塑加重[27]。NO可增加MI后血管生成，减少纤维化的生成。eNOS部分通过减轻心肌细胞肥大而减轻MI后左心室功能失调及重塑。研究证实MI模型大鼠梗死后心肌重塑还与非梗死心肌的超氧化物形成有关，Yaoita等[28]报道用冠状动脉结扎的方法建立大鼠心肌缺血模型，补充BH4可增加eNOS活性，降低心肌中性粒细胞活性，保护炎症浸润心肌的内皮细胞和心肌细胞，这主要归功于eNOS改善冠状动脉内皮功能，由此改善心肌灌注。所以补充BH4以调整eNOS偶联可作为治疗心肌缺血性损伤的治疗方法，该方法可改善冠状动脉灌注及减轻心肌重塑来保护心脏功能。另外，eNOS二聚体与单体的比值可以提示MI后eNOS脱偶联的发生，补充外源性BH4后eNOS二聚体与单体的比值上升，eNOS脱偶联减轻。大剂量口服补充BH4可改善缺血再灌注损伤对内皮功能的影响[29]。

心血管老化：衰老引起的eNOS脱偶联及NO的生物利用降低可能是导致内皮依赖血管舒张功能降低及血压升高的原因。研究发现老龄大鼠骨骼肌阻力动脉BH4水平及生物利用度降低，可能引起eNOS脱偶联，进而导致内皮依赖血管舒张功能降低，超氧化物产生增多[30]。补充BH4或其底物墨蝶岭可使eNOS复偶联，增加NO的产生，进而改善老龄小鼠内皮功能[31]。Sindler等[32]发现运动训练可通过平衡NO与ROS的产生预防衰老导致的BH4丢失并改善NO的生物利用度，从而改善eNOS脱偶联引起的内皮功能损伤。

eNOS脱偶联在心血管疾病的发生和发展中起重要作用，因此针对eNOS脱偶联和（或）其触发因素的对策可能是预防和治疗冠心病、心力衰竭、动脉粥样硬化、糖尿病及高血压等心血管疾病的有效手段，如阻断ROS的产生，补充BH4，补充叶酸以使BH2再循环为BH4，补充L-精氨酸等。

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2013-11-27）

（助理编辑：许菁）

国家自然科学基金资助项目（No.31160219）；国家国际合作项目（No.2011DFA32720）；国家973 计划项目（No.2012CB518200）

810001 青海省西宁市，青海大学医学院

赵艳霞 讲师 主要从事心血管病基础研究 Email: zhaoyanxia--03@163.com 通讯作者：格日力 Email:geriligao@hotmail.com

R54

A

1000-3614（2014）04-0315-04

10.3969/j.issn.1000-3614.2014.04.021