树鼩在肝脏疾病动物模型应用的研究进展

邢会杰，方梅霞，宋琳亮，和 君，李守军，傅江南

(1.暨南大学实验动物管理中心，广州 510632;2.华南农业大学兽医学院，广州 510642)

生物学研究中动物模型的使用仍将持续很长一段时间。由于伦理及其他如可控性、方便操作及成本效益等方面问题，许多基于人类疾病机理研究和药物研发的实验只能依赖于动物模型的建立和使用［1］。考虑到非人灵长类实际使用的限制，生物学研究中寻找非人灵长类的替代动物显得尤为必要及紧迫。树鼩(Tupaia belangeri，tree shrew)是一种生活在热带和亚热带地区的哺乳纲攀鼩类的小型动物，尽管树鼩精确的系统发育地位仍存在争论，但是一致认为其与灵长类密切关联［2］，与人类有较近的亲缘关系。最近，昆明动物研究所通过对树鼩全基因组测定和解析，发现树鼩在神经及免疫系统等方面与人类相比具有高度同源性，在很多方面具有可用来替代猕猴等大型灵长类实验动物的遗传基础，可能还适合于更多的免疫学、神经生物学及代谢等生物学问题和疾病机理的研究［3］。已有证据表明树鼩非常适合用于人体的近视、心理应激和肝炎等问题的研究，且对多种人类易感病毒敏感［4］，本文对近年来利用树鼩在肝脏疾病动物模型中的应用进展综述如下。

1 乙型肝炎病毒模型

乙型肝炎病毒 (hepatitis B virus，HBV)感染是全球和我国的重要健康问题，建立方便有效的HBV感染动物体内模型是开展HBV相关基础和临床研究的重要前提，缺乏合适的体内外感染HBV实验模型是阻碍HBV基础和临床研究发展的主要瓶颈。因此，建立方便有效的、与人类有较近亲缘关系的动物感染人HBV模型，是研究HBV的生物学特性、感染致病机理及有效防治措施所亟需的重要课题［5］。周勇等［6］将 HBV1.2 质粒通过大隐静脉用水动力注射方法转入树鼩肝脏，检测树鼩血清中ALT、HBV DNA，HBsAg、HBsAb，结果发现转染HBV1.2质粒后树鼩血清中能检测到相关阳性指标，表明大隐静脉水动力注射法能够作为树鼩肝脏外源基因导入的一种方法，这为树鼩成为慢性HBV感染模型打下了一定基础。有人对56只新生树鼩接种来自HBV感染病人或树鼩的血清后分阶段收集血清和肝脏样品，利用 qPCR、酶联免疫分析、Southern blot和免疫组化等检测分析方法，在接种48周后有6只树鼩被确定和4只疑似表现出慢性HBV感染，结果表明树鼩幼仔与人类相比具有一定的可被HBV慢性感染的频率，从而初步建立了树鼩HBV慢性感染模型［7］。同时，作者对持续感染6年HBV的树鼩通过DNA分析、肝脏超微结构电镜检测等方法发现肝细胞水肿，脂肪和嗜酸性变性，淋巴细胞浸润和门管区小胆管增生，多区域肝坏死融合形成纤维化和硬化的连接和巨红细胞症，其感染HBV病毒的肝脏病理学变化与人相似［8］。以上研究表明，树鼩具有作为 HBV感染新模型的应用前景。

2 丙型肝炎病毒模型

丙型肝炎病毒(hepatitis C virus，HCV)呈世界流行性，大约3%的世界人口遭受慢性HCV困扰，到目前为止，还没有预防或治疗HCV的疫苗面世，因缺乏合适的动物模型是导致对HCV免疫和病源机制研究和研制更有效治疗药物的主要阻碍因素之一。除了人类之外，黑猩猩是对HCV易感的唯一物种［9］。由于HCV缺乏理想的动物模型，近年来，国内外学者对树鼩是否可成为HCV感染的动物模型作过一些十分有益的尝试。Zhao等［10］阐明HCV可在树鼩原代肝细胞进行有效的复制和病毒合成，他们利用HCV病人血清或血浆感染树鼩原代肝细胞，通过反转录PCR检测到负性单链RNA和病毒颗粒证实病毒在树鼩原代肝细胞可进行有效的感染和复制。Amako等［11］等用HCV患者血清和HCV全长cDNA重组的病毒颗粒感染树鼩建立HCV树鼩模型，并经过长达3年观察，通过各项指标检测进行HCV感染树鼩后的病原学研究，结果发现急性感染阶段出现中度肝炎和断断续续的病毒血症，并可导致脂肪变性，肝硬化，结节和肿瘤。且通过组织学分析发现HCV引起的慢性肝炎和进一步恶化之间存在时间依赖性。为进一步评价树鼩HCV是否是由传染的病毒质粒引起的，用被感染HCV的树鼩血清去感染幼龄树鼩，然后通过对HCV RNA进行检测分析发现受者树鼩也表现出中度肝炎和断断续续的病毒血症，同时将具有较高丰度的HCV感染树鼩的血清接种幼年树鼩后呈现急性感染，表明树鼩可有效感染和转染HCV，但是树鼩模型和人类感染HCV后的不同之处在于树鼩较难保持HCV病人所表现的持续病毒血症现象［12］。这些结果表明树鼩有望成为HCV感染和疾病研究的有效动物模型进行HCV病因及发病机制等方面的深入研究。

3 其它病毒肝炎模型

可用于甲型肝炎病毒(hepatitis A virus，HAV)研究的动物模型较少，1981年詹美云等人对HAV感染树鼠句进行了初步的研究，他们用0.5%HAV阳性病人新鲜大便滤液0.5 mL感染9只成年树鼠句。通过检测抗原、抗体、转氨酶及肝组织病理检查等指标，在感染2～16周后，78%的树血清中检测出了HAV抗体，转阳率75%。这些证据说明树鼠句有可能成为人类甲肝病毒敏感的动物。有人认为丁型肝炎病毒(hepatitis D virus，HDV)的复制必需依靠HBV的辅助，因此HDV感染模型必须以HBV感染为基础［13］。有人以树鼩为对象研究证实在感染HBV的基础上，可通过同时和重叠感染的方式感染HDV。肝组织病理学观察发现，树鼩感染HDV后，引起的HDV的肝脏病理变化与人类的极其相似，可呈现不同的病理类型，易形成慢性发病过程，从而建立HDV/HBV实验感染树鼩动物模型［14］。Yan等［15］认为树鼩通过转染HBV/HDV病毒全基因组可以在树鼩肝脏细胞检测到病毒复制，并指出钠离子/牛磺胆酸共转运蛋白抗原(sodium taurocholate cotransporting polypeptide，NTCP)在病毒侵入和限制病毒感染方面具有重要作用。以上结果表明，树鼩具有感染甲肝及丁肝的可能，但能否作为此类肝炎病毒的有效模型，尚需进一步深入开展研究。

4 非酒精性脂肪肝模型

郭小芳等［16］为探讨罗格列酮对脂肪肝细胞PPA R表达的影响，通过对树鼩饲喂高糖高脂饲料建立树鼩非酒精性脂肪肝模型，通过实验前后检测体重(wt)、空腹血糖(FBG)、空腹血清胰岛素(FIN S)、总胆固醇(T C)、甘油三醋(T G)、高密度脂蛋白胆固醇(HDL-C)和低密度脂蛋白胆固醇(LDL-C)。实验结束时剖腹取肝标本，光镜下观察肝脏形态学改变，以免疫组化法检测肝脏过氧化物酶体增殖物激活受体(PPA R)表达水平，结果发现，高糖高脂喂养树鼩后与空白对照组相比，其FBG、FINS等均明显升高，肝脏形态学发现严重肝脂肪变性。此结果说明高糖高脂饮食可介导树鼩引起肝脂肪变性。牛昱宇等［17］使用每公斤树鼩普通饲料加20 g胆固醇和200 g猪油为高脂饲料，供树鼩自由采食的方法建立树鼩非酒精单纯性脂肪肝动物模型，结果发现7周后，60%的树鼩呈明显脂肪肝症状，14周后，80%的树鼩呈明显的脂肪肝症状，其中20%的树鼩呈重症脂肪肝症状，部分树鼩有约95%的肝细胞脂肪化。以上结果表明树鼩可用于非酒精性脂肪肝动物模型，尤其是单纯性脂肪肝的药物研究与功效评价。

5 肝癌模型

黄曲霉毒素是通过聚酮途径由黄曲霉和寄生曲霉所产生的一种对人类和畜禽危害最大、最常见的霉菌毒素。黄曲霉毒素为肝脏毒素，主要损害肝脏，除了主要诱使动物发生肝癌外，也能诱发胃癌、肾癌、直肠癌及乳腺、卵巢、小肠等部位的癌症［18］。Li等［19］利用黄曲霉素对对树鼩进行处理约90周建立树鼩肝癌模型用以研究黄曲霉毒素介导的肝细胞癌形成过程中的基因调控作用，通过对实验处理组树鼩肝脏标本进行分析发现树鼩肝脏发生癌细胞变。Yan等［20］在建立了树鼩实验感染人HBV模型的基础上，进行了黄曲霉毒素与人HBV双因素在肝细胞癌形成中作用的研究，结果首次在动物体内证实黄曲霉毒素和HBV在肝细胞癌形成过程中有协同作用。Su等［21］利用HBV和黄曲霉素对树鼩处理后，研究p53蛋白和p21蛋白在树鼩肝癌形成过程中的表达，发现p53蛋白的变异和肝癌的发生密切相关，p21蛋白的过量表达在肝癌的发生发展过程中起到重要的作用。

综上所述，树鼩在人类肝脏疾病模型中的应用已经进行了广泛的研究，但由于以往研究所用的树鼩多为野外捕获的动物，还没有实现树鼩标准化，因此，在建立树鼩肝脏疾病模型的稳定性和重复性方面存在不足，致使一些学者提出质疑，很大程度上限制了树鼩作为肝脏疾病动物模型应用的研究进展。但随着树鼩规模化繁殖、生物净化及建立相应的微生物质量控制品系后，树鼩将会在包括肝脏疾病在内的医学生物学领域发挥极大的作用，尤其在人类疾病的致病机理研究和建立人类疾病的树鼩模型对治疗药物的开发及其评价方面具有广阔的应用前景。

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