超声靶向微泡爆破联合骨髓来源干细胞治疗进展

马 笑，崔可飞

（郑州大学第一附属医院超声科，河南 郑州 450052）

骨髓干细胞是多种多向分化潜能的干细胞群的总称，因其提取方便、伦理争议小且有多分化潜能的特点，成为治疗许多疾病的新手段。然而受到移植效率低下、靶向性差的限制，导致其归巢率低，难以满足临床治疗的需要。超声靶向微泡破坏（Ultrasound targeted microbubble destruction，UTMD）技术是一种极具潜力的靶向给药新方法[1]。因其无创、靶向性好的特点，能有效提高靶组织局部药物浓度、提高疗效、降低毒副作用，将其与干细胞移植联合，可显著提高归巢率。UTMD技术有希望成为一种新的介导干细胞移植的方法，为进一步治疗缺血性疾病另辟新径。

1 基本概念

骨髓间充质干细胞（Bone mesenchymal stem cells，BMSCs）是一种来源于骨髓单个核细胞群且具有多向分化潜能的组织干细胞。利用Percoll试剂将骨髓中大部分造血细胞和单个核细胞分离开来，再经过体外贴壁培养，去除悬浮生长的造血细胞，即可获得较高纯度的BMSCs[2]。研究证明，BMSCs具有易于分离和培养、多分化潜能、免疫原性弱、伦理争议小等优点，所以被认为是最有希望用于治疗多种疾病的干细胞[3]。而且BMSCs具有自我更新、多向分化、体外容易培养及能大量扩增的特点[4-5]，在体外有分化为血管内皮细胞的潜能。

骨 髓 单 个 核 细 胞（Bone marrow mononuclear cells，BMMNCs）为一个细胞群体的总称，其内含有丰富的干细胞成分，包括造血干细胞/祖细胞、内皮干细胞/祖细胞、多潜能成体祖细胞等。除此之外，BMMNCs中尚含有其它一些功能不明的细胞成分，因而具有多向分化的能力[6]。且提取方法方便快捷，不需培养，取骨髓血用Percoll分离液离心即可获得，满足了很多急性疾病对干细胞移植的时机要求，弥补了BMSCs需培养不能立即使用的弊端。现在实验室多用于治疗各种缺血性疾病，如脑梗、心梗、糖尿病足等[7-11]。骨髓干细胞的组成复杂，从免疫组织化学染色可大致分为CXCR4+和CXCR4-两类。CXCR4+细胞具有趋化作用，可沿着活体病灶释放SDF-1至血液形成的化学梯度趋化至病灶区域从而发挥局部治疗作用。

超声微泡造影剂是一种小气泡球体，直径约1～10 μm，外面裹有脂质、蛋白质及其他大分子物质。当注射到全身时，因为尺寸的限制，他们只存在于脉管系统。内部气体内核可压缩的本性导致超声微泡比周围血液和组织更有效地散射超声波，因此，可提高自身显影。目前，超声微泡在临床上主要应用于几个主要器官中检测血流灌注，在最近的实验室研究中用于分子靶向。超声微泡，虽然过去通常是作为超声造影剂，但如今因为其特异性靶向携带药物或基因到达病变组织，变得越来越受重视[13-15]。

制备微泡常需将气体分散到某种特定液体（含能形成外壳以包封气泡的物质）中，再用探针型声振仪或高频震荡器制备成泡沫，成壳物质移到新的气-液界面并得以凝聚形成微气泡外壳。膜的稳定性决定微泡的稳定性，按膜的材料可分为白蛋白、非离子表面活性剂、脂质体、多聚体。按发展可分为四代，第一代微泡内为自由气泡，以空气和氧气为主要成分，大小不一，稳定性差，且外膜无稳定剂，不能通过肺循环。第二代微泡成分是空气，外壳为人体白蛋白，但由于微泡壳厚、易破等缺点，故不够稳定、谐振能力差。第三代微泡外壳为脂质成分，气体内核为低溶解性、低弥散性的高分子量的氟硫气体，显著提高了微泡的稳定性，直径一般为1～8 mm，小于人体红细胞，因而可经外周静脉注射后自由通过肺循环，最终到达靶器官或者靶组织，从而实现回声增强（如现在常用的声诺维（SonoVue），是目前较为理想且应用较广的声学造影剂），广泛应用于实验室研究以及临床对肝内肿块的诊断。但此种微泡仅用于超声造影，提高常规超声对肿块内血管的辨识度、灵敏度，并不能用于治疗，更不具有靶向性，且因为尺寸的限制，不能通过血管，仅作为血池内造影剂。目前，有研究报道第四代微泡，它的直径更小，趋于纳米级，且在第三代微泡的基础上进行靶向修饰，即将配体粘附于微泡的表面，通过血液循环聚集到特定的组织或器官，然后选择性地与相应受体结合，使靶区域超声信号增强，从而达到靶向诊断与治疗的目的。不同于普通微米级微泡，纳米级微泡靶向性好，且背景不增强，提高了病灶的诊断率。此种微泡一经提出立即成为研究的热点，国内外学者相继用各种方式制作各种靶向性微泡，以期为临床诊断和治疗提供新途径[16]。

2 UTMD联合干细胞作用机制

UTMD联合干细胞治疗缺血性疾病的主要机制是将附有干细胞的超声微泡造影剂或直接将干细胞、微泡相继经外周静脉注射进入全身血液循环，后在靶区以一定声强的超声照射，因血液中的超声微泡具有一定的可压缩性，即微泡特有的先后产生不对称的“压缩-膨胀”性能，使声场中的微小气泡会随着声波不断振动、膨胀、收缩，从而诱导发生空化效应[17]。利用空化效应产生的微射流和冲击波的机械损伤在细胞的质膜或核膜上出现了暂时性小孔（声孔效应），使细胞外药物和基因通过小孔进入细胞内[18-19]，从而使细胞通透性增高，进而使携带的或血液中的干细胞进入缺血细胞内，增加归巢率，从而发挥干细胞的多向分化及旁分泌功能，以改善缺血灶的血流灌注，从而在降低干细胞副作用的基础上提高疗效[20]。

微泡的靶向作用可通过主动靶向、被动靶向两方面实现：①主动靶向——微泡自身的靶向作用。现国内外学者均着重于此类靶向微泡的研制。王朝清等[21]用生物素-链霉亲和素系统成功将普通注射用SonoVue构建为靶向微泡；王红红等[22]在共价结合与静电吸附的协同作用下，制备出一种新型载药超声微泡；赵敏等[23]用静电吸附法将淋巴细胞选择素（Lymph-Selectin，L-S）链接到脂质超声微泡膜表面，制备成L-S靶向超声微泡；Unger等[24]报道用特异性寡肽和MRX408脂质微泡结合，可制备血栓靶向微泡，通过与血栓内GPIIb/Ⅲa受体结合鉴别新鲜与陈旧性血栓。尽管这些微泡尚处于实验室研究方面，未用于临床治疗，但这种靶向微泡的研制方法已给我们启示，指导我们今后制作出各种靶向性好的微泡。②被动靶向——靶向部位的超声辐照。在特定部位的靶区给予一定功率的超声辐照，该处血管内微泡破裂产生空化效应，以致特定部位的血管内膜间隙增大，增加了治疗药物的通透性。此种方式（即UTMD技术）也广泛应用于实验室研究中[25-26]。

3 应用

超声微泡造影剂最早于1968年由Gramiak首次报道应用，现已有40余年历史。它能有效增强活体的二维和多普勒超声信号，显著提高超声诊断的敏感性和特异性[27]。近些年，随着第四代微泡的报道，人们发现超声微泡不仅是一种良好的超声显像对比剂，更是一种重要的药物递送载体，实现靶向给药的目的。超声微泡给临床提供了一种靶向给药的新途径，有望解决常规药物缺乏靶向性、副作用大、疗效差的难题，成为疾病治疗研究的重点[28]。超声微泡造影剂应用在治疗疾病的领域，其中介导药物转染成为研究的热点，目前超声微泡造影剂已被公认为一种新兴的载体介导基因转染。

Zen等[29]利用UTMD联合BMMNCs治疗缺血性心肌病的仓鼠模型，结果发现，实验组仓鼠缺血心肌的毛细血管密度和心肌血流量均较对照组明显增加，从而证明该法可抑制心肌重构，阻止心衰的进展。Xu等[30]利用超声辐照静脉注射的微泡和BMSCs，通过与对照组比较发现实验组兔的心功能明显改善，心肌毛细血管数量增多，心肌纤维化的面积缩小，说明UTMD促进了BMSCs的归巢，进而发挥了治疗作用。Song等[31]将UTMD与BMSCs联合，使靶向到达心肌组织的BMSCs增多，从而改善梗死心肌的功能。Enomoto等[32]将大鼠后肢缺血模型分为对照剂组、超声辐照组、骨髓干细胞移植组，结果发现细胞移植组新生血管计数等优于对照剂组、超声辐照组，且超声辐照组、对照剂组之间差异无统计学意义，说明超声辐照本身并无治疗作用；随后他又将后肢缺血模型分为对照剂组、细胞治疗组、细胞治疗联合超声辐照组，发现细胞治疗联合超声辐照组疗效远优于单纯细胞治疗组，说明UTMD联合干细胞治疗可显著改善单纯干细胞的促进血管新生的作用。Chappell等[33]将仓鼠心肌病模型分为超声+微泡+BMMNCs组、超声+微泡组、超声+BMMNCs（无微泡）组、单纯对照剂组，12周后分析心肌样本发现，超声+微泡+BMMNCs组微血管内有标记的BMMNCs定植，且此组的毛细血管密度、血液灌注、毛细血管内粘附因子（VCAM-1和ICAM-1）的表达、心肌内VEGF和bFGF的含量均较对照组明显升高，心功能显著改善，心肌纤维化的范围和凋亡细胞的数量明显降低，说明UTMD联合BMMNCs可促进BMMNCs的靶向传递，从而提高了新生血管的密度和局部血流，抑制心肌重塑，从而阻止了心衰的发生。由此，推测这种非侵入性的细胞传递系统可能是一种新的有效的促使心肌病新生血管生长的细胞治疗方法。

4 问题和展望

近几年国内外针对载药超声微泡的研究已取得了许多重要进展。药物制剂的研究已进入靶向给药系统（Targeted drug delivery system，TDDS）时代。而UTMD技术即为一种极具潜力的靶向给药新方法[26]，相对于常用的病毒转染，它具有免疫反应小、操作方法简单、无病毒感染风险的优点[34-35]。但有些问题仍待解决：①超声微泡的安全性，在稳定状态时已有少量微泡破裂，造成对组织损害。②靶向微泡的制备方法尚未有定论，在体内实验因体内参与靶向微泡的粘附素各不相同，难以评价其特异性及粘附效能。③超声设备、参数意见尚未达成共识[36-38]，对适宜的超声强度剂量还在摸索阶段，未有定论，过大剂量可对组织造成损伤。④微泡浓度增加，促进造影效果的同时也加大了对机体损伤的风险。如何权衡造影效果与副反应风险之间的平衡点需要摸索。⑤UTMD和干细胞移植的作用机制尚未完全明确，有待进一步研究阐述。⑥UTMD和干细胞移植具有各自的优点和局限性，如何将这些治疗方法更有效的相结合值得进一步探索。

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