骨髓基质干细胞研究进展

和凤军 陈 普 陈学秋 唐柱生

云南中医学院，云南 昆明 650500

骨髓基质干细胞 (Bone marrow stromal stem cells，BMSCs)属于中胚层细胞，该细胞为多能干细胞，取材容易，对机体损伤小，易于基因操作，分离培养简便，扩增能力强，免疫性低等特点。BMSCs在某些信号和特定条件的影响下，可分化为成骨细胞、软骨细胞、神经细胞、脂肪细胞、心肌细胞等，还可以跨胚层分化，已广泛应用于脑和脊髓损伤、骨损伤、软骨缺损与损伤、心肌细胞损伤等的修复、基因治疗和临床治疗的研究，具有广阔的临床应用前景。现将骨髓基质干细胞 (BMSCs)国内外研究进展综述如下。

1 骨髓基质干细胞的发现及应用研究现状

骨髓基质干细胞 (BMSCs)又称为骨髓间充质干细胞(Bone marrow mesenchymal sterm cells，MSCs)。1976 年Friedenstein等［1］首先提出骨髓间充质干细胞 (MSCs)的概念。骨髓间充质干细胞 (MSCs)因其在培养时呈集落增殖和对塑料培养材料的贴壁特性，曾被称为集落形成单位成纤维细胞 (colony forming unit fibroblasts，CFUF)或塑料贴壁细胞。骨髓基质干细胞 (BMSCs)存在于骨髓网状间质内，可分化为骨髓基质细胞 (bone marrow stromal cell，BMSC)等。因该细胞为多能干细胞，分离培养简便，扩增能力强，免疫性低，同种移植或异种移植时免疫排斥反应弱。BMSCs在某些信号和环境的影响下，锚靠一类组织，分化成该组织细胞。在骨髓中成熟的细胞能够反分化［2-3］。在特定条件下，还可以跨胚层分化［4-5］。

有研究表明［6-7］，BMSCs体外分离培养后，在一定的信号和环境诱导下，可分化为成骨细胞、软骨细胞、神经细胞、脂肪细胞、心肌细胞等。在不同的微环境条件下已将BMSCs成功诱导分化为成骨细胞、软骨细胞、心肌细胞、脂肪细胞、肌肉、皮肤、肝、肺、神经元、神经胶质细胞等，且在人和啮齿类动物的实验中均显示了这种终身分化能力［8-11］。

BMSCs在脑源性神经营养因子 (brain-derived neurotrophic factor，BDNF)、碱性成纤维生长因子的诱导或与脑组织细胞共同培养下，BMSCs可分化为具有神经元和胶质细胞标志的细胞［12-13］，如微管相关蛋白1B、神经元特异微管 (Tubulin)、神经元特异性烯醇化酶 (NSE)以及波形蛋白。Woodbury［14］等报道，在体外增加细胞内cAMP含量，成年鼠和人的BMSCs可分化为早期神经前体细胞。Tamir A等［23］研究发现，BMSCs约10%处于S+G2+M期，大多数细胞处于G0/G1期，高比例的G0/G1期细胞说明BMSCs具有高度分化的潜能。

目前BMSCs通过蛛网膜下腔注射用于脊髓损伤临床治疗［23，26］，通过局部注射或静脉注射治疗骨关节病［24］，均取得明显临床疗效，安全性好，副作用轻，初步显示了广阔的临床应用价值。

2 骨髓基质干细胞的制备、培养及生物学特性

2.1 BMSCs的制备、培养 BMSCs主要存在于全身结缔组织，以红骨髓组织中含量最丰富，亦存在于胎儿脐血中［25］。BMSCs的体外培养始于 20世纪 70年代中期，Friedenstein等开始用贴壁的方式培养分离到BMSCs，为纺锤形细胞，经2～4d休眠后迅速增殖，且能多次传代。

迄今为止，分离BMSCs的方法有:密度梯度离心法、贴壁筛选法、流式细胞仪法、全骨髓培养法、免疫磁珠法等。密度梯度离心法是利用骨髓中各种细胞的密度不同进行分离;全骨髓培养法和贴壁筛选法是利用BMSCs易于贴壁的特性进行纯化;流式细胞仪法是根据细胞大小不同和细胞表面的特殊标志进行细胞分选。常用培养基为含体积分数为10%胎牛血清DMEM培养基。

常用的BMSCs分离液有两种:Percoll分离液 (密度1.073g/mL)和Ficoll分离液 (密度1.077g/mL)。采用密度梯度离心法和贴壁筛选法相结合，利用Percoll分离液可得到高纯度的BMSCs［15］。有研究者从脐静脉的内皮中分离出BMSCs［16］。因BMSCs取材简便，易于分离培养，组织相容性好，经培养分离纯化后可行自体移植、同种移植、异种移植。

2.2 BMSCs的生物学特性 人体骨髓中BMSCs含量很稀少，每1×105～106个单个核细胞中有一个BMSCs，体外分离培养、扩增或纯化才能满足研究和治疗的需要。对人和大鼠的荧光激活细胞分类 (fluorescence activated cell Sorter，FACS)分析表明［17-18］，BMSCs含有三个细胞亚群:①大的和明显成熟细胞 (mature BMSCs);②小的无颗粒细胞;③小的粒细胞 (RS-2 cells)。

传代培养的BMSCs细胞形态均一，呈梭形、纺锤形。从第6代开始凋亡细胞数量明显增多，培养至9代后生长缓慢，出现胞浆空泡化，胞体变大等老化现象。第3～6代可用于临床治疗使用［23］。BMSCs表达中等量MHC-I类分子，不表达MHC-Ⅱ类分子与人类白细胞抗原 (HLA)识别有关的T淋巴细胞共刺激分子，BMSCs免疫原性低，机体产生的免疫反应很弱［23］。BMSCs可分泌多种生长因子和细胞因子，如白细胞介素6、白细胞介素11、白细胞介素12等;还可分泌多种神经营养因子，如脑源性神经营养因子、胶质源性神经营养因子、神经生长因子、表皮生长因子、碱性成纤维细胞生长因子等［23］。

目前虽然尚未发现BMSCs的特异性标志物，但研究发现多能间充质干细胞表达特异性标志物如:CD68，CD44，CD77，CD90，而不表达CD34造血干细胞的特异性标志物［19］。向神经细胞转化的BMSCs不表达造血谱系标志物CD11，CD45， CD34， CD14， 而 表 达 CD44， CD71，CD90［14］。流式细胞技术测定发现，细胞贴壁附着后均一表达 SH2， SH3， CD29， CD44， CD71， CD90， CD106，CD120a，CD124等多种表面蛋白［20］。BMSCs表达多种表面抗原如粘附分子类、整合素家族、生长因子和细胞因子受体家族、干扰素受体和 TNF受体等［25］。BMSCs移植途径有:静脉注射、局部注射、硬膜内注射、蛛网膜下腔注射、腹腔注射等。

3 BMSCs向神经细胞分化的研究进展

BMSCs在EGF或BDNF诱导下可分化为神经细胞［21］。Woodbury［14］在体外用 β 巯基乙醇 (BME)及二甲亚砜(DMSO)诱导BMSCs，培养大鼠的神经细胞，80%的细胞表达神经元特异性烯醇化酶 (Neuron specific endolase，NSE)、神经微丝蛋白 (Neurofilament-M，NF-M)及尼氏体。Hou L［22］在体外分离、提纯、分化人脐带血中的BMSCs，而在Mesencult培养基中用荧光激活细胞分选术(FACS)将BMSCs在2、5、8通道诱导分化为神经元细胞。分化的神经元细胞具有特异性标志物NF、NSE及尼氏体，免疫组织化学检测显示细胞巢蛋白呈阳性表达。

4 骨髓基质干细胞的应用研究前景和展望

BMSCs因具备多向分化潜能，取材容易，对机体损伤小，易于基因操作，分离培养简便，扩增能力强，组织相容性好等特点。在某些信号和特定微环境的诱导下，可分化为成骨细胞、软骨细胞、神经细胞、脂肪细胞、心肌细胞等，还可以跨胚层分化，已广泛应用于脑和脊髓损伤、骨损伤、软骨缺损与损伤、心肌细胞损伤等的修复、基因治疗、临床治疗的研究，取得了明显的临床疗效，具有广阔的临床应用前景。而BMSCs治疗疾病的相关机理探索、BMSCs特异性标志物的发现、BMSCs移植的远期安全性评价将成为今后的研究重点和研究方向。

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