兔类风湿性关节炎模型的建立及成纤维样滑膜细胞的培养

文永兵 郭艳幸 张玉可

1.安徽中医药大学，安徽 合肥 23003;2.洛阳正骨医院，河南 洛阳 471000;3.河南中医学院，河南 郑州 450000

类风湿性关节炎 (Rheumatoid arthritis，RA)是一种以关节滑膜为主要靶组织的慢性系统性炎症性自身免疫功能障碍性疾病，主要表现为对称性、慢性、进行性多关节炎，基本病理特征为关节滑膜炎。关节滑膜炎症细胞浸润，滑膜细胞增殖，血管翳形成并侵袭关节软骨和骨组织，造成关节结构的破坏［1］。其确切病因及发病机制尚未完全明确，目前尚无有效的治疗方法。近年来研究表明，类风湿性关节炎成纤维样滑膜细胞 (fibroblast-like synovio—cytes，FLS)增生活跃，具有转化细胞的特征，能够形成肿瘤样病灶，可能是类风湿关节炎疾病发生的早期特征［2］。制备兔类风湿性关节炎模型，为研究RA的发病机制提供了一个良好的平台;体外培养FLS为临床药物的开发与评估提供了一个理想的实验条件，对进一步揭示RA的发病机制及开发防治RA的药物具有深远的意义。

1 实验材料

1.1 实验动物 健康大耳白兔8只，普通级，体重:1.5～2.0 kg，5月龄，雌雄各半，由河南康达实验动物有限公司提供，检疫合格。所有动物均在同等条件下喂养，自由饮水进食，普通饲料定时定量喂养;选择光线充足，通风良好实验环境，实验前先适应性喂养1周。

1.1 实验试剂 鸡卵蛋白粉 (Albumin Egg)，sigma A-5253;二甲基亚砜 (DMSO)，sigma;完全弗氏佐剂，美国Sigma公司，批号:F5881;DMEM/LOW GLUCOSE，批号:NXJ0702，HyClone;无支原体胎牛血清，批号:120716，浙江天抗生物科技有限公司;0.25%胰蛋白酶-EDTA消化液，批 号:90090602，Solarbio;PBS缓 冲 液，批 号:NYJ0985，HyClone;D-PBS缓冲液，批号:20120928，biohao;

1.2 设备及仪器 电子天平，XS205型，METTLER TOLEDO公司;-20℃冰箱，BCD-248WBCSLA，青岛海尔股份有限公司;-80℃超低温冰箱，3111型，Thermo;液氮罐，YDS-50B-125型，乐山市东亚机电工贸有限公司;水套式二氧化碳培养箱，Forma 3111型，Thermo;倒置显微镜，TS100/TS100-F，Nikon;电热恒温水浴锅，DKS22型，上海精宏实验设备有限公司;立式自动电热压力蒸汽灭菌器，LX-C35L型，合肥华泰医疗设备有限公司;漩涡混合器，QL-861，QILINBEI离心机，LDZ5-2，北京离心机厂;自动包埋机，EC350型，MICROM公司;石蜡切片机，HM360型，MICROM公司

2 方法

2.1 动物分组 健康大耳白兔8只，适应性喂养1周后，随机分成两组，正常组4只，模型组4只，每组雌雄各半。

2.2 造模与检测 模型组将采用1962年由 Dumonde和Glynn创立的卵蛋白诱导的关节炎模型进行造模，发病率达100% ，近期的实验研究［3］证实了模型复制的成功率。

2.2.1 试剂的配制及致敏 用电子天平量取鸡卵蛋白粉100 mg，放入离心管，注入5 ml生理盐水，在漩涡混合器上充分振荡溶解，配制成浓度为20 mg·ml-1的悬液，用10 ml注射器吸取悬液，通过针头过滤器过滤到另一无菌离心管中，在离心管中加入完全弗氏佐剂5 ml，在漩涡混合器上震荡5 min左右至混合液完全乳化，用理发器除去家兔肩胛间区兔毛，暴露皮肤，酒精消毒;用1 ml注射器抽取上述乳化液l ml，在兔肩胛间区分5个部位皮下注射致敏，每只l ml，间隔一周注射一次，连续3周致敏，注射后，注射部位皮下将产生1 cm×1 cm×1 cm大小的略圆形皮下硬结，至处死时仍未消散。

2.2.2 致敏检测 第3周致敏后1周，取上述白蛋白溶液0.1 ml在兔后臀皮下注射，24～48小时内皮试呈阳性反应(产生至少16 mm的皮肤红色隆起)为致敏成功。

2.2.3 模型的诱发 末次注射后一周，即第4周，致敏检测成功后，将兔固定于手术台上，双膝关节部位用理发器剃毛，常规酒精消毒，注射部位选择在胫骨结节最高点与髌骨下缘连线之中点的髌韧带外侧。注射时膝关节屈曲约20°由髌韧带外侧中点与皮肤呈45°角进针深度约1 cm，穿破关节囊时有突破感，选用1 ml注射器在模型兔双膝各注射0.5 ml白蛋白溶液 (含鸡卵蛋白5 mg)，注射后将兔放回原笼。

2.3 细胞培养前的准备 二氧化碳培养箱内部用75%酒精喷洒，纱布擦拭干净，紫外线灯照射30 min，内部水盘高温高压灭菌后放回，打开二氧化碳培养箱开关，向培养箱内水盘注入2000 ml蒸馏水，将二氧化碳浓度调整为0，设置温度为37℃，稳定一天，校准二氧化碳浓度后调整为5%，打开二氧化碳阀门，培养箱参数稳定在温度37℃，二氧化碳浓度5%即可，将解剖器械在

2.4 取滑膜组织进行细胞培养、传代、冻存及复苏

2.4.1 取滑膜组织 模型诱发后第2周，模型组兔双膝关节肿胀明显。从模型组中任选两只大耳白兔，麻醉后，仰位固定，无菌环境下于膝关节正中纵行切开皮肤，分离肌肉，露出膝盖骨，沿胫骨结节切断髌韧带，向上翻起，打开关节腔，用眼科剪及眼科镊取关节囊内面平滑光亮的滑膜组织，同法取另一侧膝关节滑膜层组织，放置于无菌培养皿中。取滑膜组织过程中，见模型组滑膜组织大量增生变厚，打开关节腔见大量滑液流出。

2.4.2 滑膜细胞原代组织块培养 在超净台中，用PBS液冲洗取出的滑膜组织3次，然后剪成1～2 mm3小块，PBS液洗涤离心2次，吸取上清液，将组织小块用眼科镊送入25 cm2培养瓶内，用牙科探针将组织块在瓶壁上均匀摆置，每小块间距5mm左右，放置15～20块，组织放好后，向瓶内注入1ml培养液 (含15%胎牛血清的DMEM培养基)，勿将组织块漂浮，盖好瓶盖，放置在5%CO2培养箱内，旋开瓶口少许，培养12 h，待组织块贴附后，再补加1ml培养液，继续在培养箱中培养，隔天观察组织块的贴附及周围细胞生长情况，视培养液颜色变化2～3天更换培养液。

2.4.3 滑膜细胞传代 原代细胞组织块周围出现大量成纤维细胞并占满瓶底面积约70%时，将原代细胞传代，一、二代细胞占满瓶底面积约80%～90%，进行细胞传代。传代前，将已经配制好含15%胎牛血清的DMEM培养基、D-PBS液和0.25%胰蛋白酶-EDTA消化液放入37℃水浴锅内预热约15分钟，用75%酒精擦拭超净工作台，将无菌空培养瓶、一次性吸管及废液缸放在工作台，然后打开紫外线灯照射30分钟，在超净台中合理摆放预热后并用75%酒精纱布擦拭好的液体，从培养箱内取出25cm2培养瓶，将各瓶口一一打开，同时要在酒精灯上烧口消毒，小心吸出旧培养液，用 D-PBS清洗1次，加入1.5 ml消化液，消化温度37℃，消化时间大约3分钟，倒置显微镜下观察消化细胞，胞质回缩，细胞之间不再连接成片，表明此时细胞消化适度，此时加入3倍消化液量的完全培养液中和胰酶，吸管反复吹打细胞成细胞悬液，移入15ml离心管中，平衡后将离心管放入离心机中，以1000r·min-1离心5 min，除去消化液中的EDTA，吸管小心吸去上清液，加入2ml完全培养液，用滴管轻轻吹打细胞制成细胞悬液，用血球计数板计数后，以3×105·ml-1的细胞密度分装在2～3个25cm2培养瓶中 (原代细胞较少，继续在1个瓶中培养)，放置在二氧化碳培养箱中培养。

2.4.4 滑膜细胞冻存 滑膜细胞传至第3～4代时，细胞数量增多，选生长状态好 (占满瓶底90～95%)，对数生长期细胞，对生长数量大于5×105·ml-1进行冻存，以供后期实验利用。将所有需冻存细胞前一天换液一次，预先配制好冻存液 (含20%胎牛血清的DMEM培养液:DMSO=9∶1)，依据传代方法把消化好的细胞收集于离心管中，离心机低速离心5 min，小心弃上清液，将细胞冻存液加入细胞离心管中，重悬细胞，细胞计数调整至1×106·ml-1～1×107·ml-1，用吸管轻轻吹打使细胞均匀，将悬浮细胞放置细胞冻存管中，每管1 ml，密封细胞冻存管，标明细胞种类和冻存日期，按下列顺序降温保存细胞:室温→4℃ (20 min)→ 冰箱冷冻室 (30 min)→ 超低温冰箱(-80℃过夜)→ 液氮，少量细胞仅保存在超低温冰箱存放。

2.4.5 滑膜细胞复苏 从液氮容器中或从超低温冰箱中取出原代细胞冻存管后，立即将细胞冻存管直接浸入37℃水浴中，在2 min内摇动细胞冻存管至冻存的细胞融化，用酒精消毒后，拧开冻存管，用吸管吸出细胞悬液，注入离心管并滴加10倍以上培养液，混合后低速离心5 min，除去上清液，用培养液适当稀释后，接种密度约5×105·ml-1接种至25cm2培养瓶，放在二氧化碳培养箱中静置培养，次日更换一次培养液，继续培养。

2.5 取正常组及模型组兔膝关节病理检测 模型诱发后第2周和第6周分别取正常组和模型组各一只白兔双膝关节，用于病理切片观察，操作步骤如下:耳缘静脉栓塞法处死白兔，仰卧固定，膝关节剃毛后作纵切口，横断胫骨结节下约1 cm髌骨上约1 cm肌肉，暴露胫骨及股骨，锯条横断胫骨、股骨，取出完整双膝关节，装入标本袋，分别注明日期及组别，用10%福尔马林液固定48 h，将标本放入10%甲酸溶液，脱钙2周，送检验科包埋、切片。

3 讨论

RA的病理基础是滑膜细胞的大量增生，而滑膜是关节的重要组成部分，有润滑关节，维持关节稳定的作用，滑膜出现病变，势必造成关节的病变。近年的研究证明RA的主要病因在于滑膜的病变，滑膜和炎性细胞形成血管翳，从而产生肿瘤样的侵蚀作用，对关节软骨造成破坏［4］。由卵蛋白诱导的白兔类风湿性关节炎在发病机制，病理改变方面更接近人类RA，较好地模拟了免疫性疾病的微环境［5］。膝关节是全身关节中滑膜最多的关节，易于进行药品注射及细胞移植治疗，且它与人的手足小关节大小相近，对指导RA好发部位的治疗很有意义［6］，因此采用此法对动物造模并取双膝关节滑膜组织体外培养并储备，对后期的药物实验研究提供很好的研究材料。笔者在对白兔造模中发现，在前3周致敏后，注射部位皮下有大小不等的硬结，长期不消退，第四周臀部注射进行致敏检测，48 h后出现局部强烈的免疫反应，局部红肿，一周内检测部位出现溃烂，说明致敏是成功的。造模过程中，观察造模前后饮食、膝关节周径及兔体重变化，造模成功后第2周，取兔膝关节滑膜的操作中，见模型组滑膜组织增生肥厚明显，关节腔内大量滑液流出，均与文献上记载的相符［7］。

研究发现，卵蛋白诱导的兔RA模型，在关节腔诱导后第1～4周为膝关节滑膜增生的高峰期，4周后出现不可逆的软骨破坏［8］。笔者在模型诱发后第2周取模型组兔膝关节滑膜组织进行细胞培养，第2周和第6周各取一只正常组和模型组兔双膝关节进行病理检测。在孙贵才等人实验研究中发现组织块培养法是获取优质滑膜细胞的最佳方法［9］。笔者在用组织块培养法对兔膝关节滑膜组织培养中发现，从滑膜组织植入培养瓶算起，第3天发现组织块周围有少量细胞游离出，约一周后组织块周围有大量成纤维样细胞游离出组织块，少量为非纤维样，第10天对原代滑膜细胞传代，传代后约经过3～4天传第二代，继续培养，传至第三代滑膜细胞形态单一，呈梭形，占满瓶底80%～90%时，呈漩涡状分布。第三代细胞形态单一，活性强，数量大，将细胞冻存后备用。1月后，将冻存在液氮和-80°冰箱中的滑膜细胞同时以相同的密度接种在25cm2培养瓶中，第二天，观察细胞的贴壁情况，两者差异不大，冻存在液氮里的滑膜细胞复苏后3天长满瓶底，在-80°冰箱中的滑膜细胞复苏后4天长满瓶底，所以，后期实验周期短的实验，滑膜细胞可以直接放置在-80°冰箱中暂时保存。

关节腔诱导模型成功后第2周取正常组兔及模型组兔双膝关节病理检测结果示:模型组兔双膝关节滑膜组织明显增生，正常组兔未见滑膜组织增生;第6周取正常组兔及模型组兔双膝关节病理检测结果示:模型组兔双膝关节滑膜组织明显增生，并有血管翳形成和不同程度的软骨及骨破坏，正常组兔未见异常，模型组RA的诱导是成功的。

总之，卵蛋白诱导的兔RA模型方法简便，成功率高，为临床研究RA的发病机制及治疗手段提供了一个良好的实验平台，通过对模型组兔膝关节滑膜细胞培养条件的摸索，可以成功培养出实验用细胞，并成功冻存与复苏，是后期体外实验深入研究RA的前提与基础。

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［4］Chang SK，Gu Z，?Brenner MB.Fibroblast-like synoviocytes in inflammatory arthritis pathology:the emerging role of cadherin-11，Immunol Rev 2010，233(1):256-266.

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［6］Romero FI，Margnez-Calatrava Mj，Sánchez-Pemante O，et a1.Pharmacological modulation by celecoxib of cachexia associated with experimental arthritis and atherosclerosis in rabbits ［J］.Br J Pharmacol，2010，161(5):1012-22.

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