硫化氢促进结肠癌细胞的生长

蔡文杰，王 艳，随 力，王铭洁

（1.上海理工大学医疗器械与食品学院医学基础教研室，上海 200093；2.复旦大学上海医学院生理与病理生理学系，上海 200032）

硫化氢（H2S）是一种具有广泛生物学效应的气体信号分子［1］，我们曾报道了 H2S具有促血管新生的能力［2－3］，而血管新生可促进肿瘤细胞的增殖和扩散。结肠癌细胞能表达合成H2S的两个酶：胱硫醚-β-合酶 （CBS）和胱硫醚-γ-裂解酶 （CSE），其中CSE含量远大于CBS的含量［4］。本实验通过干扰内源性H2S的生成来探讨其对肿瘤生长的影响。

1 材料与方法

1.1 实验材料 HCT116细胞购自上海中科院细胞库，6周龄BALB／c裸鼠由复旦大学实验动物中心提供，BrdU参入试剂盒购自Roche公司。

1.2 shRNA慢病毒的制备 针对CSE基因设计shRNA序列，克隆到 pGLVH1／GFP载体，与 pRsv-REV、pMDlg-pRRE、pMD2G共转293T细胞，3 d后收集培养液，超速离心后得到慢病毒。

1.3 裸鼠移植瘤实验 分为干扰组和对照组，分别用CSE干扰慢病毒和阴性对照慢病毒感染细胞，获得稳定表达株。干扰组细胞接种于鼠左肋部皮下，对照组细胞则接种于同一鼠的右肋部皮下，接种量都为2×106个细胞。肿瘤体积按V＝1／2长径×短径2计算。

1.4 细胞增殖 细胞换无血清后给予不同浓度的NaHS处理24 h，用10μmol·L－1BrdU孵育2 h，再分别用抗BrdU抗体、HRP标记的二抗处理，TMB显色后在450 nm波长处检测吸光度。

1.5 统计学分析 数据以¯x±s表示，用Systat 12软件进行统计学处理，多组间比较用单因素方差分析，两组比较用t检验。

2 结果

2.1 CSE干扰慢病毒构建成功 Real-time PCR实验显示，针对CSE基因895位点的shRNA序列（5′-GCCCAGTTCCTGGAATCTAATTTCAAGAGAATTAGATTCCAGGAACTGGGCTT-3′）能抑制 CSE基因的表达，抑制率达到（87.8±3.9）%。

2.2 干扰CSE表达抑制移植瘤的生长 HCT116细胞接种裸鼠皮下10 d后，处死并取出瘤组织，干扰组与对照组肿瘤大小分别为：（0.28±0.05）cm3与（0.63±0.14）cm3，肿瘤重量分别为：（0.25±0.05）g与（0.59±0.11）g。两组比较差异均有显著性（P＜0.05，n＝8）。

2.3 H2S促进体外细胞增殖 外源性给予50μmol·L－1NaHS后细胞增殖，与对照组相比提高了（20.5±4.8）%（P＜0.05），给予 200μmol·L－1NaHS后促进增殖达（28.6±6.2）%（P＜0.01），差异具有显著性。抑制内源性 CSE表达后，与对照组相比细胞增殖略有下降，差异无统计学意义（P＞0.05，n＝6）。

3 讨论

结肠癌细胞中CSE含量远大于CBS的含量［4］，因此我们设计了针对CSE的shRNA慢病毒，通过降低CSE的表达来减少了内源性H2S的产生。体外实验中，外源性给予H2S能促进细胞增殖，但干扰内源性生成后细胞增殖无明显变化，可能是因为在细胞培养环境中内源性产生的H2S浓度低且易扩散，导致对照组与干扰组间无明显差异。而在裸鼠移植瘤中，干扰组明显抑制肿瘤生长，这很可能是因为干扰组局部微环境的H2S浓度比较低，抑制了血管新生，所以肿瘤细胞生长缓慢。Szabo等［5］最近通过干扰CBS来抑制内源性H2S的生成，发现肿瘤内新血管的生成明显减少，这证实了我们的猜想，同时也提示了CBS和CSE这两个酶对结肠肿瘤的生长都很重要。

参考文献：

［1］ 蔡文杰，琚立华，朱依纯.硫化氢的治疗性应用研究进展［J］.中国药理学通报，2009，25（7）：854－6.

［1］ CaiW J，Ju L H，Zhu Y C.Research progress on hydrogen sulfide’s potential therapeutic use［J］.Chin Pharmacol Bull，2009，25（7）：854－6.

［2］ CaiW J，Wang M J，Moore P K，et al.The novel proangiogenic effect of hydrogen sulfide is dependent on Akt phosphorylation［J］.Cardiovasc Res，2007，76（1）：29－40.

［3］ Köhn C，Dubrovska G，Huang Y，et al.Hydrogen sulfide：potent regulator of vascular tone and stimulator of angiogenesis［J］.Int J Biomed Sci，2012，8（2）：81－6.

［4］ CaiW J，Wang M J，Ju L H，et al.Hydrogen sulfide induces human colon cancer cell proliferation：role of Akt，ERK and p21［J］.Cell Biol Int，2010，34（6）：565－72.

［5］ Szabo C，Coletta C，Chao C，et al.Tumor-derived hydrogen sulfide，produced by cystathionine-β-synthase，stimulates bioenergetics，cell proliferation，and angiogenesis in colon cancer［J］.Proc Natl Acad Sci USA，2013，110（30）：12474－9.