曾凡才 赵太强 周 红(电子科技大学生命科学与技术学院,成都610054)
Nodal分子是胚胎发育中一个重要的形态发生素分子(Morphogen),属于转化生长因子-β(Transforming growth factor-β,TGF-β)超家族成员。它在维持胚胎干细胞的未分化状态、诱导中胚层和形成内脏器官左右不对称性等过程中发挥重要作用[1]。Nodal基因在胚胎发育早期高表达,而在胚胎晚期呈低表达,在成年正常个体中仅表达于少数几种生殖系统组织[2]。最近研究表明Nodal分子在多种恶性肿瘤中表达,并与肿瘤的发生、发展、浸润和转移密切相关,说明Nodal分子可能作为肿瘤诊断的标志分子和靶向治疗的靶点。本文将综述Nodal分子的特点及其与肿瘤的关系。
1993年,Zhou等[3]首先从小鼠胚胎cDNA文库中克隆获得Nodal基因,并定位于10号染色体。人Nodal基因也位于10号染色体(10q22.1)上,该基因包含有3个外显子和2个内含子[4]。Nodal基因除编码区外,至少还包含三个独立的转录调控区域,分别位于转录起始位点上游大约10 kb的结节特异性增强子(Node-specific enhancer,NDE)、转录起始位点上游大约4 kb的左侧体轴增强子(Left sidespecific enhancer,LSE)和第一内含子中的不对称增强子(Asymmetric enhancer,ASE)[5]。Nodal基因编码的蛋白质属于TGF-β超家族成员,Nodal前体蛋白由347个氨基酸组成,其中1~26位氨基酸是信号肽(Signal peptide),27~237位氨基酸是前体结构域(Prodomain),238~347位氨基酸是成熟肽结构域(Mature domain)。在PACE-4和Furin等枯草杆菌蛋白酶样前体蛋白转换酶的作用下,Nodal前体蛋白可生成一条含110个氨基酸的成熟多肽[1,6]。该成熟多肽具有TGF-β超家族的特征性结构,即含有7个保守的半胱氨酸。成熟多肽通过一对二硫键连接生成具有生物学活性的同源二聚体Nodal分子。
Nodal分子在胚胎发育过程中起重要作用,敲除Nodal基因会导致小鼠胚胎死亡,人Nodal基因先天性突变也可导致内脏异位症的发生[4]。Nodal分子主要表达在胚胎组织中,在成年正常组织中一般不表达[2]。最近研究发现Nodal分子表达于多种恶性肿瘤细胞中,提示Nodal分子可能与肿瘤细胞增殖和转移有关[7],然而Nodal分子在肿瘤中表达的机制和功能并未完全清楚。
与其他TGF-β超家族成员类似,Nodal分子以旁分泌和自分泌方式发挥作用。分泌于胞外的Nodal前体蛋白在前体蛋白转换酶的作用下,加工成具有生物学活性的同源二聚体。成熟的Nodal分子与细胞膜上的激活素Ⅱ型受体B(Activin typeⅡreceptor B,ActRⅡB)和激活素Ⅰ型受体(Activin receptor-like kinase,ALK)4(ALK4)或ALK7以及共受体Cripto-1相互作用将信号传递到胞内。与Nodal结合的Ⅱ型受体ActRⅡB以及Ⅰ型受体ALK4和ALK7均属于丝氨酸/苏氨酸激酶受体,此两类受体都由一个短的胞外结构域,一个单跨膜结构域和一个长的胞内激酶结构域组成。在胞外结构域中有糖基化位点和富含半胱氨酸区域。在Ⅰ型受体胞内近膜区域有一保守的富含甘氨酸和丝氨酸的GS结构域,此结构域在Ⅱ型受体中缺失。当成熟的二聚体Nodal分子与Ⅱ型受体ActRⅡB二聚体结合后,再与两分子Ⅰ型受体ALK4或ALK7靠近并催化Ⅰ型受体GS结构域磷酸化,使Ⅰ型受体被激活。激活的Ⅰ型受体可使胞内的Smad2(receptor-regulated similar to mothers against decapentaplegic homolog)磷酸化,Smad2与Smad4形成复合物,从细胞质转位到细胞核,与FoxH1和Mixer1等转录因子以及辅激活物或辅阻遏物结合,调控靶基因表达以发挥相应生物学效应[8]。通过这条信号通路Nodal分子不仅能够促进其天然抑制因子Lefty-A和-B的表达,还可正反馈的刺激Nodal分子自身表达,以平衡Nodal分子在生物体内的作用[7,9]。
3.1 Nodal分子与肿瘤的发生和发展 胚胎干细胞表达的Nodal分子在细胞分化发育中发挥重要作用,而一般成年正常组织中不表达Nodal分子,但在恶性肿瘤细胞中又重新表达。已有研究发现在低表达Nodal分子的肿瘤细胞中上调Nodal表达会促进细胞增殖、减少细胞凋亡和增加细胞浸润能力[7,10,11]。而在高表达 Nodal分子的肿瘤细胞中抑制Nodal表达会明显降低肿瘤细胞的致瘤性[7,10,11]。研究发现 Nodal分子可通过促进基质金属蛋白酶MMP2表达进而增加肿瘤细胞的浸润能力,Nodal分子还能增加VEGF的表达从而促进肿瘤血管生成[11-13]。动物实验表明:Nodal分子可促进乳腺癌转移灶形成和黑色素瘤的肺转移[5,10]。我们的研究也发现Nodal分子在恶性乳腺癌和结肠癌组织中高表达,而在癌旁正常组织不表达或低表达(待发表)。上述结果表明Nodal与肿瘤的发生和发展可能密切相关,但是Nodal分子在肿瘤中的功能及其重新表达的机制尚不清楚,下面介绍Nodal分子在几种肿瘤中作用的研究进展。
3.2 Nodal分子与黑色素瘤 多项研究表明Nodal分子在黑色素瘤发生和发展中发挥重要作用。Topczewska等[7]发现 Nodal分子在正常皮肤不表达,在低浸润性黑色素瘤中低表达,但在转移性黑色素瘤中高表达。另外,Nodal分子在具有转移能力的黑色素瘤细胞系C8161、WM278和1205LU中高表达,而在非转移性的黑色素瘤细胞株C81-61中低表达或不表达[7]。这提示Nodal分子可作为黑色素瘤发展过程中的生物标志分子。在黑色素瘤细胞C81-61中,用ALK4/5/7受体抑制剂SB-431542阻断Nodal信号通路,可使该细胞在裸鼠移植瘤中的浸润能力显著降低;用 Nodal靶向的 Morpholino(MONodal)特异抑制Nodal的表达,可明显降低该肿瘤细胞在裸鼠中的致瘤性。当MONodal对Nodal表达抑制失效(即有Nodal重新表达)时,该细胞的致瘤性也恢复。进一步研究证明:这种Nodal抑制引起的黑色素瘤细胞致瘤性降低是由于它的增殖抑制和凋亡加快的结果[14]。临床研究数据表明Nodal分子表达与黑色素瘤进展正相关,提示Nodal分子有可能作为肿瘤治疗的靶点[5]。McAllister等[15]研究认为Nodal基因表达与代表黑色素瘤恶性发展的血管生成拟态样结构形成相关。另一组研究人员用免疫组化方法检测黑色素相关疾病组织中Nodal分子表达,发现Nodal分子在正常组织及发育异常痣中呈低表达,但随恶性黑色素瘤的发展,Nodal分子表达逐渐增加[16]。有研究认为肿瘤的低氧环境诱导了黑色素瘤细胞中Nodal分子表达,从而增加了黑色素瘤细胞的浸润性和血管生成能力[17]。Fang等[18]发现Nodal可通过转录因子Snail促进肿瘤的恶性发展。以上结果表明Nodal在黑色素瘤发展过程中起重要作用并与黑色素瘤进展正相关,可成为黑色素瘤治疗的潜在靶点。
3.3 Nodal分子与乳腺癌 在乳腺组织中,Nodal分子在发育期乳腺导管上皮细胞中表达,并促进乳腺导管分枝形成,而且Nodal表达异常可导致导管上皮解体[19]。因此,Nodal对乳腺的正常分化发育十分重要,在成年人正常乳腺导管上皮细胞中不表达,然而在乳腺癌细胞株和乳腺癌组织中均出现高表达[14,20]。与低浸润性乳腺癌细胞株 MCF-7 和T47D相比,Nodal在高浸润性乳腺癌细胞株MDAMB-231、MDA-MB-468 和 Hs578t中表达增强[10]。Nodal促进乳腺癌细胞增殖和减少细胞凋亡,并且与乳腺癌转移灶形成密切相关[10]。与黑色素瘤类似,低氧环境可诱导乳腺癌细胞Nodal表达,增加癌细胞的浸润性和血管生成能力[17]。临床研究发现低分化浸润性乳腺癌比良性和早期乳腺癌有更高的Nodal表达,而且用特异性Nodal单克隆抗体明显减少乳腺癌细胞增殖并诱导肿瘤细胞凋亡[20]。丰富的血管对恶性肿瘤是必需的,高的微血管密度也是肿瘤预后不良的指标,有研究证实Nodal高表达能促进乳腺癌中血管生成从而促进肿瘤的发展[13]。以上结果表明虽然Nodal对乳腺的正常发育是必需的,但表达异常可能促进乳腺癌的发生和发展。
3.4 Nodal分子与胶质瘤 人胶质瘤细胞株中Nodal表达水平与这些细胞株浸润能力呈正相关[11]。用重组Nodal(rNodal)蛋白处理胶质瘤细胞会增加MMP-2的分泌和细胞浸润能力。在低表达Nodal分子的低浸润性胶质瘤细胞GBM中上调Nodal分子表达会增加MMP-2分泌,增强细胞浸润性和增殖能力以及体内肿瘤细胞的生长,促进移植瘤小鼠死亡。在高表达Nodal的高浸润性胶质瘤细胞U87MG中,用shNodal抑制Nodal分子表达会减少MMP-2分泌,降低细胞浸润性,促进恶性胶质瘤细胞向星状细胞分化逆转,抑制体内肿瘤细胞生长,延长移植瘤小鼠生存期。此外,Nodal还诱导白血病抑制因子LIF和Cripto-1使胶质瘤进一步恶化。
进一步研究表明shNodal可通过抑制VEGF表达阻止胶质瘤血管的发生[12]。在人胶质瘤组织中,Nodal表达与VEGF表达呈正相关。在人U87MG胶质瘤细胞株中,用RNAi抑制内源性Nodal表达可明显减少细胞克隆形成和VEGF分泌。体内实验表明:抑制U87MG细胞中的Nodal表达能够阻止胶质瘤和肿瘤血管生长以及延长小鼠的生存期。Nodal诱导VEGF表达至少部分通过ERK1/2-HIF-1 alpha介导的信号通路。最近有研究认为Nodal通过其受体ALK4和ALK7及Smad3促进胶质母细胞瘤细胞U87生长[21]。上述研究表明 Nodal可通过促进MMP-2分泌和VEGF表达进而促进胶质瘤的恶性发展。
3.5 Nodal分子与前列腺癌 临床研究发现Nodal分子在前列腺癌组织中高表达[22]。稳定转染prepro-Nodal真核表达质粒可促进前列腺癌细胞LNCaP在Matrigel和软琼脂上的生长[22]。Nodal分子在前列腺干细胞WPE和癌细胞DU145、LNCaP和LNCaP-C81中高表达,而在正常和永生化的前列腺细胞PREC、RWPE1和RWPE2中不表达或低表达。用重组Nodal蛋白可诱导前列腺癌细胞PC3细胞迁移,并且这种作用可被Nodal信号通路抑制剂SB-431542所抑制[23]。这些研究表明Nodal蛋白参与前列腺癌的发生、增殖和迁移。
3.6 Nodal分子与胰腺癌 Nodal分子表达也与胰腺癌相关。Nodal分子在高分化的胰腺癌细胞中不易检测到,但在胰腺癌干细胞和胰腺间质来源的星状细胞中明显高表达[24]。胰腺星状细胞是作为胰腺肿瘤间质细胞的重要组成部分,它为胰腺肿瘤干细胞营造一个旁分泌微环境。研究发现胰腺星状细胞分泌Nodal促进胰腺肿瘤干细胞球囊的形成和增加肿瘤细胞的浸润性[25],并且抑制Nodal信号通路可抑制胰腺肿瘤干细胞自我更新能力和体内致瘤性,以及增加肿瘤干细胞移植瘤对化疗药物吉西他滨的敏感性[24]。
4.1 抑制Nodal分子表达对肿瘤治疗的影响 在乳腺癌细胞MDA-MB-231移植瘤小鼠模型中,用Nodal分子靶向的Morpholino(MONodal)抑制Nodal分子表达,明显降低移植瘤的形成,并促进肿瘤细胞凋亡[26]。MONodal还可降低黑色素瘤移植瘤小鼠的肿瘤发生率和抑制肿瘤生长[7]。shNodal抑制浸润性乳腺癌细胞中Nodal表达,明显降低肿瘤的形成,并促进肿瘤细胞凋亡[10]。在高表达Nodal的U87MG胶质瘤细胞中shNodal在抑制Nodal表达的同时可抑制肿瘤血管生长、减缓移植瘤生长和延长小鼠生存期[11,12]。用shNodal处理后还可抑制胰腺肿瘤干细胞的自我更新能力和体内致瘤性,并增加肿瘤干细胞移植瘤对化疗药物吉西他滨的敏感性[24]。以上研究表明Nodal分子在肿瘤的发生、发展、侵袭和转移过程中起关键作用,靶向抑制Nodal分子的表达可减缓肿瘤的进展。
4.2 阻断Nodal通路对肿瘤治疗的影响 Lefty-A和-B属于TGF-β超家族成员,它们是Nodal的天然抑制因子。Lefty-A和-B可与 Nodal直接结合使Nodal不能与受体结合从而阻断 Nodal信号通路[27]。研究表明用人胚胎干细胞(human embryonic stem cell,hESC)来源的Lefty-A和-B可抑制Nodal在黑色素瘤和乳腺癌细胞中表达以及细胞克隆形成。在黑色素瘤小鼠移植瘤中注射hESC来源的Lefty-A和-B可明显促进黑色素瘤细胞凋亡和降低Ki67的表达[14]。研究发现人肝干细胞(Human liver stem cell,HLSC)通过生成Lefty-A,可抑制Nodal表达,进而抑制 HepG2细胞的生长和促进细胞凋亡[28];而骨髓来源的间充质干细胞(Bone marrowderived mesenchymal stem cell,MSC)无 Lefty-A 表达,因而没有类似的作用。最近研究也发现Lefty-A可抑制Nodal的促胰腺癌细胞增殖作用[29]。另外,由于SB-431542可特异性地阻止ATP与NodalⅠ型受体ALK4或ALK7结合,使NodalⅠ型受体不能引起Smads的磷酸化从而阻断Nodal信号通路。因此,SB-431542可作为肿瘤治疗的候选药物。上述研究结果说明利用某些抑制因子阻断Nodal分子与其受体结合或阻断Nodal分子与其受体结合后的信号通路可抑制肿瘤细胞生长和促进细胞凋亡。
Nodal分子在胚胎发育过程中有重要作用,一般在成年正常组织中不表达,而最近发现Nodal分子在恶性肿瘤中高表达,在肿瘤的发生、发展、侵袭及转移过程中有重要作用。靶向阻断Nodal分子信号通路,对肿瘤治疗具有重要意义。用天然抑制因子、化学小分子抑制剂、RNA干扰或者特异性单克隆抗体可靶向抑制Nodal信号通路,从而抑制肿瘤的进展。研究显示,Nodal单克隆抗体可减少黑色素瘤血管生成拟态的形成[29],降低转移性黑色素瘤细胞C81-61在小鼠移植瘤中转移到肺的能力[5]。另外,Nodal单克隆抗体明显抑制乳腺癌细胞增殖和促进了肿瘤细胞凋亡[20]。但是Nodal分子在肿瘤中的治疗作用仍面临许多问题,如Nodal分子也可能像TGF-β一样,有双向调节作用,虽然多项研究都认为Nodal分子有促肿瘤作用,但也有研究认为Nodal分子可抑制肿瘤细胞增殖和促进细胞凋亡,这说明Nodal发挥不同功能可能与细胞所处环境相关。虽然Nodal分子在多种肿瘤中高表达,有可能成为一个临床诊断标志分子,但目前还没有关于Nodal分子表达与病人长期预后分析的报道,这些问题还有待于进一步的研究。
综上所述,Nodal分子与多种恶性肿瘤的发生、发展、浸润和转移密切相关,Nodal分子可成为肿瘤诊断的标志分子和肿瘤靶向治疗的潜在靶点。
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