酶联免疫吸附试验检测结果的影响因素和应对措施

张春艳

（吉林省白城市中心血站，吉林 白城 137000）

酶联免疫吸附试验检测结果的影响因素和应对措施

张春艳

（吉林省白城市中心血站，吉林 白城 137000）

酶联免疫吸附试验；影响因素；应对措施

酶联免疫吸附试验（ELISA）是血站检验献血者血液是否符合既定标准的常用检测方法，其基本方法是将已知的抗原或抗体吸附在固相载体表面进行酶标记的抗原抗体反应，用洗涤法洗除液相中的游离成分。因其具有操作简单、灵敏度高、特异性好、达纳克水平和经济安全等优势，广泛为临床实践所应用。但在检验实际操作过程中，在各种主客观因素的影响下，可影响检测结果的准确性。为此，笔者总结分析ELISA试验操作各个环节中容易出现的问题和注意事项，以不断提高检验质量，满足各种需求。

1 试剂的准备

目前各种ELISA试验均有商品化的专用试剂盒。应选择质量优良、有批准文号的检测试剂，试剂必须在有效期内使用，实际操作时严格执行试剂说明书。试剂从冰箱取出后，应放在室温或37 ℃条件下30 min再进行检测。保存试剂盒的冰箱应经常检查储存温度并做好记录，冰箱应避免频繁开关。试剂使用前应摇匀。

2 标本的采集和保存

血站ELISA试验所用标本均为血清，临床上使用的标本还包括经过预处理的唾液、尿液、粪便等生物材料。

对于含有免疫物质的标本，可干扰试验，使结果出现假阳性或假阴性。干扰因素包括两类，其中内源性因素包括类风湿因子、补体、高浓度的非特异性免疫球蛋白等，主要通过试剂的合理选择予以有效避免。外源性因素包括标本溶血和凝固、被细菌污染、储存时间过长等，实际工作中应采取避免溶血[1]和污染的措施。否则，红细胞溶解时会释放具有过氧化物酶活性的亚铁血红素的血红蛋白；应避免污染标本，一旦污染菌体中可能含有内源性HRP，当以HRP为标记时，可增加非特异性显色而出现假阳性的结果。应保持检测标本处于新鲜状态，需低温保存推迟检测标本，分别在2～8 ℃和低温条件下保存7 d内和7 d后检测的血清标本。同时，反复冰融会使抗体效价降低，需多次测定抗体的血清标本应采用少量分装并冰存的保存方法。应充分离心血清标本，否则可因纤维蛋白原的残留使其在微孔吸附而致假阳性结果。

所以，实验室人员应按要求认真查对血清标本，拒收不符合要求的标本和申请单，为避免溶血要及时分离合格标本的血清，并保证其中不得混有大量纤维蛋白或细胞成分，保证检测结果的准确性。不能及时检测的标本要按要求保存并作好记录，标本从冰箱取出后要按常规处理用于检测。

3 加样、育温、洗涤、显色和比色

3.1 加样：在试验操作中，加标本、加酶结合物和加底物为循序渐进的加样流程。前者一般采用手工或者微量加样器的方法加样。但应注意：①每次手工加样前必须更换吸嘴以避免交叉感染；②为保证准确加样，应揣摩并熟练掌握加样技巧；③必须定期维护和校准加样器，因为使用时间过长，因机械磨损或推动杆内血痂附着等原因造成加样不准。加酶结合物和底物可直接滴加，一般不用微量加样器。每次加样时，为避免加在孔壁上部，应置所加物于ELISA板孔的底部，不得出现溅出、产生气泡等现象，加酶试剂后要用吸水纸轻轻擦拭吸干酶标板。加底物操作时，不得混用各试剂盒显色剂，不得颠倒添加顺序，不得溅出孔外。较多标本时，为避免因加样板过多所致加样后等待时间过长放入孵箱，尤其在较高室温条件下操作要分批进行。最后为保证混匀，在微型振荡器上震荡1 min。

3.2 温育：酶联免疫吸附反应是在固相表面发生的一系列反应，只有经过扩散后抗原抗体结合才能达到反应的终点，可见温育需要一定时间，也是检测结果的关键影响因素之一，最为明显的是弱阳性标本[2]。水浴法、微波辐射法和温箱法为最常用的温育方式，第一种方法能较好地解决周围孔与中央孔因受热不均衡所致吸光度误差。37 ℃适合大多数抗原抗体反应是最常用的温度，另外尚可采用是4 ℃、室温和43 ℃。为了迅速平衡各板温度，可使反应板漂浮在水浴箱水面上，但不得叠放；反应板应加盖或贴封纸，目的在于防止标本或稀释液蒸发在孔壁上吸附。应准确掌握温育的温度和时间，因为温度不准影响反应过程，时间过长可在反应孔周围出现非特异性结合导致花板，这难以彻底洗涤。

3.3 洗涤：影响ELISA检测结果准确性的关键因素之一是洗涤。操作者应严格按照要求洗涤，将游离酶标志物和结合酶标志物分离开来，可以将残留在板孔中没有参与反应的物质和反应过程中吸附于固相载体的干扰物质予以清除。要按要求设置自动洗板机洗板的时间、间隔、次数，次数较少可造成残留出现假阳性结果，次数过多可洗脱抗原抗体结合物出现假阴性结果[3]。要保证洗液注满各孔，防止在反应孔中形成气泡而造成洗涤不充分。洗板结束后，应在干净无尘的吸水纸上轻轻拍干。如洗液量不足，影响洗板效果，可堵塞洗板针，不完全抽吸，洗板不畅，不能彻底洗板。

3.4 显色：显色是酶催化底物由无色到有色的过程，影响检测结果准确性的因素为反应的温度和时间。在一定时间内，温度适当提高，阴性孔可保持无色，随时间延长阳性孔则呈色加强。在定量检测中，力求准确掌握底物加入后的反应温度和时间。为减少实验误差，提高临界值样本的分析准确度，因肉眼直接判断结果存在个体差异应尽量避免，最好通过酶标仪观察测定显色结果。应注意，加显色剂时，要保持显色剂不外流。加终止液时应避免产生较多气泡，否则可能使假阳性结果的出现概率增加。

3.5 比色：目视法简单明了，但对同一标本结果判定有一定的个体差异，甚或截然不同的结果。比色的结果通常用光密度表达，现按规定用吸光度表达。但不应在阳光或强光照射下安置酶标仪，应在15～30℃室温条件下进行操作，使用前要先预热15～30 min仪器，确保检测结果的准确性。比色前，应将板底附着的液体用洁净的吸水纸擦拭干净，然后将其放在酶标仪的比色架上。

4 固相载体和抗原

4.1 固相载体：进行酶标记测定的基本条件是吸附于固相载体中的可溶性抗原或抗体变为不溶形式，聚苯乙烯或聚氯乙烯微量反应板及塑料管为常用固相载体。微量反应板所用试剂量少，操作方便，但每批微量反应板对抗原或抗体蛋白质的吸附性能是有显著差别的。因此，在使用每批制品前，必须经过实验室鉴定合格后方可使用。鉴定的方法：按规定随机抽取每批固相载体，包被用0.2 μg/mL纯化正常人IgG，洗涤后加酶标记抗人球蛋白进行反应，再经孵育洗涤，加底物显色终止反应后，在酶标比色计中逐孔测定其消光值和光密度值。鉴定标准：一般认为，全板中每两孔间光密度值误差在10%以下为合格；如果中间孔光密度值与四周孔相差较大，或者反应板的一边光密度值与另一边凹孔相差较大，均不合格；检查阳性和阴性参考血清光密度值的差异在10倍左右为合格。微量反应板或塑料管在使用前用蒸馏水冲洗即可应用，不一定经过特殊处理。

4.2 抗原：抗原或抗体包被于固相载体表面，其来源和制备方法可影响检测结果的准确性。抗原要求必须可溶、优质和稳定，具有高纯度和高免疫原性。当抗原纯度不高时，其中的杂质会竞争固相载体上的有限位置，使其敏感性和特异性下降；制备包被抗原时，其免疫学活性不应受到破坏。一般能用于补体结合试验的可溶性抗原均可用于ELISA，在作ELISA时，必须要有1～2种试剂、要求纯化，但在包被用表面活性剂提取的抗原前必须将表面活性剂透析除去，否则难以吸附到固相载体上。包被固相载体时要用浓度适当的抗原或抗体蛋白，如浓度太高则抗体效价低，可能测不出来；过量包被形成多层抗原吸附，可能造成脱落，检测结果的敏感性和可重复性得以降低。

5 实验人员素质因素

人员素质是影响检验结果的首要因素。思想素质、业务素质、心理素质、身体素质组成实验室人员的主要素质。首先，实验人员的思想素质应良好，因为其服务对象包括献血者和受血者，其道德水平直接关系到人们的健康和生命安危。所以，必须应该热爱专业，耐心细致，一旦出现如标本混淆、报告单记录错误等现象，可能危害受血者的身心健康；其次，实验人员应有高超的业务素质。要熟练掌握本专业的基本理论和基本操作技能，认真学习检验医学前瞻性知识，不断提高自己的业务能力和水平，适应岗位需求。心理素质要求检验人员应勇于面对工作生活中的挫折和压力，有条不紊，冷静沉着地开展各项检验工作。

综上所述，保证ELISA检测结果准确可靠的必要条件是具有优质的试剂，良好的仪器和正确的操作。在实际应用过程中，操作者必须熟练掌握基本操作技能，严格仔细的核查每个环节，尽量避免假阳性和假阴性反应的出现，保证检测结果真实可靠。

[1] 孙鑫,陈彦,张继瑜,等.不同程度溶血对ELISA法检测血清HBVM的影响[J].世界感染杂志,2004,4(2):174-176.

[2] 徐锡霞,邓巍.温育条件对ELISA定性测定HBsAg结果的影响[J].实用肝病杂志,2005,8(1):16-18.

[3] 刘祖勇.增加洗板次数对HBsAg ELISA检测影响[J].中国输血杂志,2006,19(2):135-136.

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1671-8194（2014）29-0393-02