胱抑素C及其检测方法的研究进展

叶余辉

（广西北海市人民医院检验科，广西 北海 536000）

胱抑素C及其检测方法的研究进展

叶余辉

（广西北海市人民医院检验科，广西 北海 536000）

收集并比较关于胱抑素C及其测定方法的相关资料，探讨其生物学特性，检测方法的种类，特点及影响因素。胱抑素C水平是反映肾小球滤过功能的可靠指标，其诊断性能与菊糖清除率相当，显著优于血尿素、血肌酐及内生肌酐清除率。临床多选择胶乳增强透射免疫比浊法或胶乳增强散射免疫比浊法作为常规检测胱抑素C的测定方法。

胱抑素C；测定方法；生物学特性；肾小球滤过功能

菊糖清除率一直被认为是反映肾小球滤过率的“金标准”，但菊糖是外源性物质，测定方法繁杂，操作繁琐，不能满足对危急患者的快速检测，因此尚未能在临床上广泛开展，使应用受到了限制[1]。胱抑素C（cystatin C，cys C）即半胱氨酸蛋白酶抑制蛋白C，人体每日分泌量较恒定，相对分子质量为13×103，由于相对分子质量小，故可自由透过肾小球滤过膜。原尿中cys C几乎全部被近端小管上皮细胞摄取、分解，并不回到血液中，尿中仅排出微量，能很好的替代血肌酐而成为一种新的反映肾小球滤过率的理想标志物[2]。本文就胱抑素C及其检测方法的研究进展概述如下。

1 胱抑素C的生物学特性

半胱氨酸蛋白酶抑制剂(cysteine proteinase inhibitor，CPI)由Anastasi等在1983年从鸡蛋清中分离纯化得到，目前中文多称之为胱抑素C。它是一种碱性非糖化的低相对分子质量分泌性蛋白质，等电点为9.3，相对分子质量为13×103，由122个氨基酸组成[3]。采用等电聚焦层析法可分离为CPIcⅠ和CPIcⅡ两型。CPIcⅠ的一级结构中只有一条肽链，含两个蛋氨酸残基和四个半胱氨酸残基及分子内二硫键。CPIcⅠ与CPIcⅡ具有相同的免疫学活性，对热及碱性环境稳定。二者的一级结构具有同样的N端，故有人认为CPIcⅡ是CPIcⅠ的磷酸化形式[4]。

胱抑素C的基因编码位于人类第20号染色体短臂上，含3个外显子，大约为7.3 KD，胱抑素C基因含有管家基因，因此能在所有组织恒定且持续地转录和表达。所有有核细胞均可合成胱抑素C并很快分泌到细胞外，无组织特异性，可分布于肾、肝、胰、肠、胃、肺及胎盘等几乎全身所有组织，在脑脊液和精液中浓度最高，尿液最低[5]。

目前，对胱抑素C的生物学功能了解不多，其最重要的生理功能是调节半胱氨酸蛋白酶活性，在胶原代谢中能水解某些前激素蛋白，对组织蛋白酶B、瓜蛋白酶、无花果蛋白酶、溶酶体释放的组织蛋白酶H和L具有抑制作用。直接与胱抑素C基因突变有关的疾病是遗传性脑出血伴淀粉样变，可造成脑血管破裂、脑出血等严重后果。胱抑素C在人体内每日分泌量较恒定，属于内源性物质，其清除通过肾脏进行，肾小球滤过率决定了血清胱抑素C的水平，因此血清胱抑素C可作为反映肾小球滤过率变化的内源性标志物，某些疾病可引起胱抑素C在人体其他体液中含量的变化[6]。

2 胱抑素C的测定方法

胱抑素C主要临床应用是作为肾小球滤过率标志物，其测定方法很多，包括单向免疫扩散法、酶联免疫测定法、荧光免疫法、时间分辨荧光免疫法、放射免疫法、胶乳颗粒法、胶乳增强免疫比浊法等。目前临床多选择胶乳增强免疫比浊法作为常规检测胱抑素C的测定方法[7]。

2.1 单向免疫扩散（SRID）：在混入一定量抗体的琼脂中，使待测的抗原溶液从局部向琼脂内自由扩散，可溶性抗体与相应抗原在比例适当处出现肉眼可见的沉淀环或沉淀，根据沉淀环的直径或沉淀的面积计算大小计算胱抑素C的含量。本法须手工操作、检测时间长，过程复杂，影响因素较多，灵敏度差，无法自动化，不利于临床应用。

2.2 酶联免疫测定法(ELISA)：使抗原或抗体吸附在某种固相支持物表面，并保持其免疫活性，酶标抗体或抗原在液相中催化底物显色，根据颜色反应的深浅来进行胱抑素C含量的定量分析。本法为手工操作，不需要昂贵的仪器，试剂成本低，临床应用较广，但不适合急诊样本的检测[8]。

2.3 荧光免疫法(FIA)：在一定条件下，使用激发光照射待测物质，当待测物吸收一定的入射光后，可发射出较入射光波长稍长的光，根据发射光强度的大小计算胱抑素C的含量。本法需要昂贵的荧光免疫分析仪，试剂成本高，但灵敏度好，特异性强，结果快速、准确，检测低限为（1 μg/L）。

2.4 时间分辨荧光免疫法（TRFIA）：用铕作标志物，直接检测血清中胱抑素C的含量，根据铕元素螯合物的发光特点，用时间分辨技术测量荧光，同时检测波长和时间两个参数，可有效地排除非特异性荧光的干扰，极大地提高了分析灵敏度。由于需要特殊的仪器设备，且所需检测时间较长，难以在临床普及应用。

2.5 放射免疫法（RIA）：通过杂交瘤技，获得胱抑素C的单克隆抗体而建立起来的胱抑素C的RIA测定方法，是利用同位素标记的与未标记的抗原同抗体发生竞争性抑制反应的方法。本法结果准确，特异性强，灵敏度为（1.3 μg/L），线性范围为（0.6～1.7 mg/L），试剂成本低。但试剂保存时间短，存在放射性污染，操作麻烦，检测时间长。

2.6 胶乳颗粒法：1994年Kaabanda等报道用胶乳颗粒法检测胱抑素C。胶乳颗粒法是一种免疫比浊测定法，该法操作简便快速，变异系数和误差小，易于自动化，但检测敏感度低（检测限为150 μg/L）。

2.7 胶乳增强透射免疫比浊法（PETIA）：在胶体溶液中，抗原胱抑素C与其抗体特异性结合，生成不溶性抗原-抗体复合物粒子，使反应溶液浊度增加，在特定波长下检测吸光度改变，与标准品比较可计算出胱抑素C的浓度。本法可以利用生化分析仪进行比浊测定，整个分析过程只需要几分钟。测定回收率在100%±20%范围内，测定值的变异系数小于10%，测定范围0.4～8.0 mg/L，测定偏差不超过±10%。溶血、黄疸和脂浊标本对测定结果没有明显干扰[9]。

2.8 胶乳增强散射免疫比浊法（PENIA）：在胶体溶液中，抗原胱抑素C与其抗体特异性结合，生成不溶性抗原-抗体复合物粒子，使反应溶液浊度增加，使用散射比浊仪进行散射比浊分析。检测范围为0.23～7.25 mg/L，回收率为95%～109%，批内CV＜3.5%，批间CV＜5.0%，不受三酰甘油、胆红素、血红蛋白、类风湿因子和骨髓瘤异常蛋白的影响。

上述研究表明，SRID、ELISA、RIA法用于测定胱抑素C所需时间长，不能自动化，不适用于大批量标本和急诊的检测，且RIA法存在放射性污染。TRFIA、FIA法所用仪器昂贵，检测成本高，未能在医院广泛使用。PETIA和PENIA法检测的灵敏度虽然较其他方法低（150 μg/L），但是低于正常参考值下限，标本溶血、黄疸和脂血对检测结果影响不大，回收率和重复性均在允许范围之内，能进行自动化分析，可作为临床常规检测方法。

3 胱抑素C的水平

国内外对血清及各种体液胱抑素C的参考值进行了研究，正常人血清胱抑素C为（0.96±0.20）mg/L，脐带血为(2.08±0.33)mg/L，婴儿：＜1个月为（0.18±0.04）mg/L，＜12个月为（0.39±0.09）mg/L，＞12个月为（0.72±0.29）mg/L。脑脊液为（5.371±0.36）mg/L，唾液为（1.22±0.67）mg/L，关节液为（1.27±0.41）mg/L，尿液为（0.11± 0.125）mg/L，精浆浓度最高平均为51 mg/L[10]。国内研究者用PETIA法对健康受检者进行胱抑素C测定，结果男性为0.62～0.91 mg/L，女性为0.52～0.83 mg/L，且胱抑素C水平随年龄增加而增加[11]。1～19岁年龄组为（1.016±0.130）mg/L，20～50岁年龄组为（1.023±0.114）mg/L，50岁以上组为（1.209±0.279）mg/L，50岁以上组增高较明显[12]。参考值的确定需要根据实际使用的检测方法、试剂及本地实际情况建立。

4 胱抑素C测定的影响因素

样品在25 ℃室温保存可稳定6 d，2～8 ℃密封保存，可稳定12 d，-80 ℃可保存14个月，忌反复冻融。影响测定结果的主要因素是实验方法及其参考曲线的制定，与性别，年龄，身高、体质量无关[13]。

5 胱抑素C的临床应用

胱抑素C主要应用于反映肾脏肾小球滤过率。由于胱抑素C分泌恒定，浓度不受含蛋白质饮食、身高、体质量等影响，干扰因素较少，是反映肾小球滤过功能的可靠指标。对肾衰竭的诊断比肌酐诊断早1～2 d[14]。血清胱抑素C水平对轻度肾功能损伤反映灵敏，用来评价糖尿病患者的肾功能状况和对肾移植患者出现排斥反应提供早期诊断[15]。一些研究发现，孕妇、重度烧伤、多发性骨髓瘤、过敏性紫癜患者的早期肾损害中胱抑素C也是很理想的监测指标[16-19]。在肝脏疾病中胱抑素C水平显著升高[20]。此外，在高血压、心脑血管疾病、脑膜炎、恶性肿瘤的鉴别诊断等方面也有良好的应用价值。

6 小 结

临床胱抑素C检测多用PETIA法，参考值的确定需要根据实际使用的检测方法、试剂及本地实际情况建立。因此方法的标准化，试剂和标准品的统一，有助于方法学的比较和参考值的建立。胱抑素C与肾小球滤过率的线性关系优于尿素、肌酐和内生肌酐清除率，在各种疾病造成肾脏早期损害的诊断、治疗及预防方面的应用越来越广，并且在其他疾病的诊断、治疗和预防上也不断的得到应用。

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