金属硫蛋白在缺血性脑损伤过程中的调控作用

郭家彬，冯 敏，张 丽，彭双清

(军事医学科学院疾病预防控制所毒理学评价研究中心，北京　100071)

金属硫蛋白在缺血性脑损伤过程中的调控作用

郭家彬，冯 敏，张 丽，彭双清

(军事医学科学院疾病预防控制所毒理学评价研究中心，北京100071)

金属硫蛋白(MT)是一类富含半胱氨酸残基的低分子量金属连接蛋白。在中枢神经系统中主要有MT-Ⅰ,Ⅱ和Ⅲ亚型。MT可广泛参与中枢神经系统的神经细胞生长、自主防御反应、免疫调节和脑损伤修复等活动。MT具有清除自由基、调节脑细胞离子稳态、重金属解毒、抗炎症和抗细胞凋亡等多种重要生物学功能。脑缺血应激可显著诱导脑组织细胞MT的表达。近年来越来越多的研究表明,MT对脑缺血损伤具有重要保护作用,有可能成为预防和(或)治疗脑缺血疾病的重要靶点。本文简要综述中枢神经系统中MT的表达与调控特点以及脑缺血应激对MT表达的影响,重点讨论MT对脑缺血损伤的保护作用及其可能机制。

金属硫蛋白；中枢神经系统；脑缺血

金属硫蛋白(metallothionein，MT)是一类富含半胱氨酸残基、低分子量(6～7 ku)的非酶类金属连接蛋白质，1957年由哈佛大学的 Margoshes和Vallee博士在马的肾皮质中首次分离发现。在哺乳动物中，MT主要由肝和肾合成，但其他多种器官和组织中也有广泛分布。在人体中，MT主要由一类位于染色体16p13的基因编码，至少可能涉及10个已知的功能基因[1]。X射线衍射晶体分析法和NMR波谱法研究显示，MT分子结构中含2个不同的结构簇，可通过结构簇中的半胱氨酸残基分别与3个和4个二价金属离子结合，包括必需微量元素(Zn和Cu离子等)以及有毒重金属(Cd和Hg离子等)[2]。生理条件下，MT主要与Zn离子结合，被称为体内组织细胞Zn离子的“贮库”。

至今研究发现，哺乳动物体内MT共有4种亚型，即MT-Ⅰ～MT-Ⅳ，其中以MT-Ⅰ和MT-Ⅱ为主要异构形式(通常合称为MT-Ⅰ/Ⅱ)。MT-Ⅰ又可进一步分为MT-Ⅰa，MT-Ⅰb和MT-Ⅰc等多种亚亚型，MT-Ⅱ也同样存在多种亚亚型[1]。在中枢神经系统中MT有 3种亚型，即 MT-Ⅰ/Ⅱ和 MT-Ⅲ。其中，MT-Ⅰ/Ⅱ在脑内组织细胞有着广泛表达，且主要分布在胶质细胞，MT-Ⅲ主要分布在神经元。MT可广泛参与中枢神经系统的自主防御反应、免疫调节和脑损伤修复等活动，具有清除自由基、调节脑细胞离子稳态、重金属解毒、抗炎症反应和抗细胞凋亡等多种重要生物学功能[1－2]。近年来越来越多的研究表明，MT对脑缺血损伤具有重要保护作用，有可能成为预防和(或)治疗脑缺血疾病的重要靶点[3－4]。脑缺血应激可激活MT的表达，并由此产生自主保护作用。外源性MT诱导剂或MT可有效减轻脑缺血损伤，应用MT-Ⅰ/Ⅱ或MT-Ⅲ转基因动物模型研究结果进一步确证MT对缺血性脑损伤具有重要的保护作用[1，3]。MT抗脑缺血损伤的作用机制还不清楚，可能与清除自由基、维持金属离子稳态、线粒体功能调节和抗细胞凋亡等作用有关。本文简要综述中枢神经系统中MT的表达与调控特点以及脑缺血应激对MT表达的影响，并讨论MT对缺血性脑损伤的保护作用及其可能机制。

1 中枢神经系统中MT的表达与调控

生理条件下，MT-Ⅰ/Ⅱ在脑中的mRNA和蛋白表达水平均较低，而且在胚胎及新生脑中均有表达。随着机体生长，MT-Ⅰ/Ⅱ的表达也不断增加，在中枢神经系统中的分布也越来越广泛。MT-Ⅰ/Ⅱ是脑内MT的主要亚型，在胶质细胞、脉络丛细胞、内皮细胞和脑膜细胞等脑细胞中有着广泛表达。其中，星形胶质细胞是脑内MT-Ⅰ/Ⅱ的主要来源。神经元细胞仅表达少量的MT-Ⅰ/Ⅱ。MT-Ⅲ是一种脑特异性MT，又称为生长抑制因子。MT-Ⅲ主要分布在海马CA1～CA3区的神经元细胞，在嗅球、大脑皮质细胞和小脑的浦肯野细胞中也有少量分布。长期以来，MT被认为是一类细胞内蛋白，主要表达在细胞核，在细胞质溶酶体和线粒体等细胞器中也有少量分布，这一特征与保护细胞核DNA和维持胞内Zn离子稳态密切相关[1]。近年来研究提示，MT在细胞内外均有分布。细胞外的MT有可能作为一种重要的细胞通讯分子，在不同脑细胞之间的“对话”中发挥重要作用[5]。例如，Chung等[6]研究表明，脑损伤发生后星形胶质细胞中MT-Ⅰ/Ⅱ的表达显著增加，并将MT-Ⅰ/Ⅱ释放至细胞外以抑制神经元损伤。MT作为一种小分子蛋白，可穿过细胞核膜和细胞膜，容易在细胞核和线粒体等不同细胞器之间以及细胞与细胞之间实现穿梭转位。MT在细胞核与胞浆之间的转位依赖于特定的胞浆伴侣蛋白和核结合蛋白，MT本身也可以发生分子结构改变，使其更容易穿过核孔复合体。

MT是一类可诱导蛋白质，在中枢神经系统中亦是如此。大量研究表明，重金属离子、脑缺血、低温应激、激素、谷氨酸盐、药物毒物作用以及电离辐射等因素，均可迅速活化MT-Ⅰ/Ⅱ的转录合成，从而增加脑组织细胞中MT-Ⅰ/Ⅱ的表达，这一反应对于机体抑制炎症反应和氧化应激等有害效应、发挥自主防御作用有着重要意义[1－2]。MT-Ⅲ同样也可被诱导表达，但MT-Ⅲ和MT-Ⅰ/Ⅱ对外源性刺激因素的反应性可能存在较大差异。除缺氧应激、细胞因子、脑损伤和多巴胺等因素外，大部分能诱导MT-Ⅰ/Ⅱ表达的因素却不能有效诱导MT-Ⅲ表达。MT的表达调控主要发生在转录水平，且通常依赖于一种协调方式。MT基因的启动子中存在针对不同转录因子的多个结合位点，包括金属反应元件，糖皮质激素反应元件和转录信号转导蛋白和激活子等[7－8]。金属转录因子-1(metal transcriptional factor-1，MTF-1)是一种复合型锌指蛋白，与金属反应元件连接并发生相互作用。研究提示，MTF-1可能是调节MT基因表达的主要调控因子，在Zn等金属离子诱导的MT表达中可能发挥关键作用，并介导氧化应激和缺氧等外源性刺激对MT的诱导表达[8]。Zn是MT连接的主要金属离子，也是调控MT表达的最重要的因素之一。Zn可与MTF-1连接，迅速启动MT基因的转录活化，从而增加MT的生物合成。而Zn缺失时，MTF-1可能与Zn反应抑制剂形成一个复合物称作MT转录抑制剂，从而阻止MTF-1和金属反应元件反应并抑制MT-Ⅰ/Ⅱ基因的表达[7]。MT的表达同样也存在转录后调控以及翻译后修饰机制，其蛋白质表达水平并不一定反映mRNA水平[9]。MT表达调控的具体机制还不十分清楚，不同因素对MT表达的调控可能涉及不同的作用机制。

2 脑缺血应激对MT表达的影响

人们已经应用多种模型研究脑缺血应激对MT表达的影响及其机制，包括大鼠、小鼠和犬等动物模型以及体外培养的脑细胞模型。体内外研究表明，脑缺血应激可显著诱导MT-Ⅰ/Ⅱ和MT-Ⅲ的表达发生改变，且MT的表达改变通常在脑缺血损伤之前就已经发生。以小鼠脑中动脉阻塞模型研究为例，Yousuf等[10]研究表明，大脑中动脉阻塞(middle cerebral artery occlusion，MCAO)术后2 h可观察到海马组织中MT含量呈明显增加。Wakida等[11]研究表明，MCAO后6 h可观察到MT-Ⅰ和MT-Ⅱ的蛋白表达呈明显增加，且以MCAO术后24 h MT-Ⅰ/Ⅱ增加最为显著。MT-Ⅰ/Ⅱ的表达改变主要发生脑皮质和皮质下区域，其中脑皮质神经胶质原纤维在酸性蛋白阳性细胞中MT表达改变最为明显，脑血管中MT-Ⅰ/Ⅱ的表达也出现显著增加。MT-Ⅰ/Ⅱ的基因表达对脑缺血应激可能更为敏感，MCAO术后6 h可观察到脑皮质中MT-ⅠmRNA水平呈明显上升，但随后出现下降，而脑皮质中MT-Ⅱ的mRNA水平则在MCAO术后一直呈时间相关性增加[11]。Yanagitani等[12]研究表明，脑缺血应激同样也可诱导MT-Ⅲ的表达增加，而且在脑缺血损伤早期和后期增加MT-Ⅲ的表达均能有效减轻脑缺血神经损伤。这些研究提示，MT表达上调可抑制脑缺血损伤，但不同亚型的MT对脑缺血应激可能存在不同的反应性，脑组织不同区域MT对缺血应激的敏感性也可能有所不同。脑细胞体外氧-糖剥夺培养是一种常用的模拟脑缺血应激的体外模型。体外研究表明，氧-糖剥夺可诱导脑皮质胶质细胞和神经元、脑血管内皮细胞MT-Ⅰ/Ⅱ的表达改变，且MT-Ⅰ与MT-Ⅱ的改变程度存在着一定的差异[13－14]。

脑缺血应激诱导MT表达的机制还不清楚，一些研究推测MT的表达上调可能与脑缺血应激引起的脑组织细胞活性氧(reactive oxygen species，ROS)生成增加有关。脑缺血条件下，脑组织细胞能量供应不足，可导致脑细胞ATP合成障碍而ROS形成增加。氧-糖剥夺可迅速诱导神经元、星形胶质细胞和脑血管内皮细胞等脑细胞ROS形成增加。ROS可促进金属反应元件与MT启动子的结合，进而激活MT-Ⅰ/Ⅱ基因的转录及其信号转导，增加MT的生物合成[15]。另有研究表明，缺血应激可促进脑细胞外Zn离子向胞内转运，而Zn离子是诱导MT表达的最有效的因素[7，16]。然而，细胞内过量的Zn离子蓄积则可能引起细胞毒性改变，甚至引起神经细胞死亡。此外，脑缺血应激还可导致细胞释放大量的谷氨酸盐以及肿瘤坏死因子和白介素6等细胞因子，进而诱导MT的表达增加[3－4]。

3 MT对脑缺血损伤的神经保护作用

近年来越来越多的研究证实，MT对脑缺血应激诱导的脑损伤具有明显的保护作用。尽管在生理状态下，MT-Ⅰ/Ⅱ或MT-Ⅲ敲除对动物功能和神经行为等生理指标没有明显影响，但MT-Ⅰ/Ⅱ和(或) MT-Ⅲ敲除动物对脑缺血应激诱导的损伤却更为敏感[10－12，17]。不管是在小鼠局灶性脑缺血模型或永久性脑缺血模型，还是在暂时性脑缺血或脑缺血再灌注模型中，均发现MT-Ⅰ/Ⅱ小鼠脑缺血损伤更为严重[10－11，17]，而MT-Ⅰ基因过表达小鼠则对脑缺血应激更为耐受[18]，这些研究提示MT-Ⅰ/Ⅱ具有明显的神经保护作用。类似的研究发现，MT-Ⅲ敲除小鼠同样对脑缺血应激诱导的神经细胞凋亡和氧化损伤敏感[19]。采用体内和(或)体外研究表明，白藜芦醇、西洛他唑、红细胞生成素、二异丙酚和低温应激可诱导MT-Ⅰ/Ⅱ或MT-Ⅲ的表达并抑制脑缺血应激诱导的脑组织或脑细胞损伤，而将MT-Ⅰ/Ⅱ或MT-Ⅲ基因敲除或敲低则可明显降低这些保护剂对脑缺血损伤的神经保护作用，从而进一步确证MT对脑缺血神经损伤的保护作用[10－11，13－14，17，20]。最近研究表明，外源性给予MT-Ⅱ可显著抑制暂时性脑缺血引起的大鼠神经行为学改变和脑组织氧化损伤[21]。Sohn等[22]研究表明，将外源性MT-Ⅲ导入脑细胞表达也可有效抑制海马CA1区的神经细胞死亡。这些研究证实，内外源性或外源性MT-Ⅰ/Ⅱ或MT-Ⅲ均可具有较好的抗脑缺血损伤神经保护作用。值得注意的是，McAuliffe等[23]研究表明，新生MT-Ⅰ/Ⅱ敲除小鼠对脑缺血应激诱导的神经损伤更为敏感，但其神经行为学改变与野生型小鼠却并没有明显差异。这一研究提示机体对MT-Ⅰ/Ⅱ的缺失存在一定的行为学代偿机制，以保护脑缺血应激诱导的神经行为学改变。

4 MT抗脑缺血损伤的可能作用机制

4.1 清除自由基与抗氧化作用

自由基诱导的氧化损伤是脑缺血损伤的重要特征。大量研究表明，脑缺血应激可诱导脑细胞产生多种自由基，包括超氧阴离子、过氧化氢(H2O2)、羟自由基(·OH)等ROS和一氧化氮(NO)等活性氮自由基[24]。过量的自由基可攻击脑组织细胞的成分，如脂质、蛋白质和DNA等，引起脂质过氧化、蛋白质羰基化和DNA氧化损伤等。体内实验研究表明，MT-Ⅰ/Ⅱ或MT-Ⅲ敲除小鼠对脑缺血应激诱导的氧化损伤更为敏感，而外源性给予MT-Ⅱ或MT-Ⅲ则能有效减轻脑组织氧化损伤[10－11，19－23]。 这些研究提示，清除自由基、抗氧化可能是MT发挥抗脑缺血神经保护作用的重要机制。MT分子结构中富含巯基，其清除自由基、抗氧化作用已受到广泛关注。体外实验研究表明，MT是一种高效的自由基清除剂，其分子中的20个巯基残基均可参与自由基的清除反应。MT在细胞浆及细胞核内均有分布，能与包括各种ROS以及氮自由基在内的多种自由基发生反应并有效地对其进行清除。Quesada等[25]体外实验研究表明，MT可作为H2O2的首要攻击靶标，其分子中的巯基残基可先于谷胱甘肽及其他蛋白中的巯基残基与H2O2直接发生反应。体外·OH清除动力学实验研究表明，MT对·OH的清除效率是谷胱甘肽的340倍，是超氧化物歧化酶的800倍，是谷胱甘肽过氧化物酶的1000倍[25]。MT基因表达调控的分子规律研究表明，MT结构基因上游区域存在抗氧化反应元件及金属反应元件(可能作为调控MT基因表达的增强子)[15]。氧化应激状态下，MT基因上游的ARE和MRE可迅速活化MT的转录，同时激活MT与氧自由基的清除反应[1，5]。然而，MT清除自由基的具体作用机制还有待进一步研究。

4.2 Zn离子稳态调节

哺乳动物脑内含有大量Zn离子，主要分布在海马、皮质、杏仁体和纹状体等组织。胞内Zn离子主要聚集在突触小泡内，其浓度可高达毫摩尔水平。生理条件下，Zn离子在神经信号转导、突触传递、脑内金属离子稳态调节以及神经细胞生长和死亡调控等活动中具有重要作用[8]。脑缺血应激条件下，Zn离子作为一种内源性的神经递质从神经末梢释放出来，容易在突触间隙内聚集，引起脑内Zn离子稳态失调[7]。游离型Zn离子大量增加是介导脑缺血神经细胞死亡的重要原因。MT是与Zn离子螯合的主要蛋白，其分子结构中含多个可与Zn离子相连的结构域。通常1分子MT可与7分子Zn离子螯合，为调节脑内Zn离子浓度稳态提供强大的缓冲作用。Zn离子浓度升高可迅速诱导MT表达，这可能部分解释了脑缺血应激诱导MT表达增加的原因。与此同时，MT通过增加对Zn离子的螯合并形成Zn-MT复合物，从而降低游离型的Zn离子、维持脑内Zn离子稳态，最终减轻Zn离子介导的神经细胞死亡[7]。

4.3 线粒体功能调节

线粒体是细胞能量代谢的主要场所，为细胞提供超过90%的ATP。同时，线粒体在细胞生长、信号转导和死亡调控等生命活动中也发挥着十分重要的作用。近年来越来越多的研究提示，MT的神经保护作用与调节脑细胞线粒体功能密切相关[26]。脑细胞属高耗能细胞，含丰富的线粒体，其能量代谢和生物合成等非常活跃，这对于维持脑细胞的能量需求与正常生理功能有着重要意义。线粒体是细胞内ROS生成的主要场所，同时也是ROS攻击的主要靶标。MT一方面有可能通过清除自由基而减轻脑缺血应激诱导的ROS生成增加和氧化损伤；另一方面也可能通过稳定线粒体膜电位和钙离子稳态等作用，从而抑制脑缺血应激引起的线粒体功能紊乱。体内实验研究表明，白藜芦醇有可能通过上调MT的表达、进而抑制脑缺血引起的线粒体功能紊乱，最终抑制脑缺血应激诱导的神经损伤[10]。研究提示MT也有可能通过调节线粒体生成功能而发挥其神经保护作用[27－28]。线粒体生成功能是修复神经损伤的重要机制。脑缺血应激可迅速激活脑组织细胞线粒体生成功能，以促进脑组织细胞损伤修复[29－30]。我们研究表明，尽管生理状态下，MT敲除小鼠生理功能与野生型小鼠没有明显差异，但在MT缺失小鼠及其来源的神经细胞对氧化应激诱导的线粒体功能破坏却更为敏感，提示MT的保护作用与调节线粒体生成功能密切相关[27，31]。此外，MT还有可能通过调节线粒体自噬以发挥其神经保护作用[32]。

4.4 抗神经兴奋性毒性效应

脑缺血可导致细胞释放大量的兴奋性递质，引起兴奋性毒性而导致脑细胞死亡。谷氨酸是一种常见的兴奋性神经递质，脑缺血应激可导致神经元的谷氨酸能神经末梢囊泡释放增加，同时促进谷氨酸转运体的逆转运，导致神经细胞胞外谷氨酸浓度升高[33]。此外，脑缺血应激状态下一些死亡细胞可出现崩解，使胞质中的谷氨酸释放，进一步加剧谷氨酸浓度的增加。谷氨酸的释放可激活N-甲基-D-天冬氨酸受体等突触后的相应受体，进而诱导Na/Ca离子内流以及质膜去极化，最终导致细胞死亡[33]。星形胶质细胞是脑内表达MT的主要细胞，它可通过“谷氨酸-谷氨酰胺”循环有效减少脑细胞外谷氨酸的浓度，这一功能与其富含MT密切相关[34－35]。应用MT转基因动物结果表明，MT敲除小鼠来源的神经元/星形胶质细胞对N-甲基-D-天冬氨酸受体引起的兴奋性毒性更为敏感，提示MT对神经兴奋性毒性效应具有明显的保护作用[31]。

越来越多的研究证实，MT是一种具有神经保护作用的多效应蛋白。除上述机制外，MT抗脑缺血损伤作用还可能与调节脑组织细胞炎症反应和免疫反应、调节钙离子稳态和神经营养因子表达以及抑制脑细胞凋亡有关[5，35]。MT的神经保护效应可能是多种机制共同作用的结果，其具体作用机制还有待进一步的广泛研究。

5 展望

MT作为一种具有多种生物学功能的金属结合蛋白，在脑缺血损伤的发生与发展过程中发挥着重要的调控作用。深入认识MT在脑缺血损伤中的作用，对于阐明脑缺血损伤的作用机制、开发相关保护作用具有重要的意义。基于脑内MT的表达与调控特征以及脑缺血应激对MT表达的影响，提示MT有可能作为一种表征脑缺血损伤的重要标志物。在脑缺血发生发展过程中，MT的表达水平以及分布改变均可能具有重要临床意义。通过合适的药理学干预措施诱导内源性的MT的表达或给予外源性MT，可有效减轻脑缺血损伤，提示MT有可能成为预防和(或)治疗脑缺血损伤的潜在靶点。然而，由于MT在机体多种组织器官均有表达，且易受多种因素影响而出现表达改变，目前还没有MT特异性的诱导剂。特别是在中枢神经系统中，受血脑屏障和MT本身表达复杂性等因素的影响，MT的抗脑缺血损伤作用向临床转化还存在一定的困难。近年来，组织特异性MT表达和靶向给药技术的发展为进一步了解MT在中枢神经系统中的作用提供了有力工具，将有可能成为MT抗脑缺血作用的重要方向。

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ReguIatory roIe of metaIIothionein in process of ischemic brain injury

GUO Jia-bin，FENG Min，ZHANG Li，PENG Shuang-qing
(Evaluation and Resarch Center for Toxicology，Institute of Disease Control and Prevention，Academy of Military Medical Sciences，Beijing100071，China)

Metallothionein(MT)is a cysteine-rich and low-molecular metal binding protein.Three isoforms of MT have been found in the central nervous system，including MT-Ⅰ，Ⅱ，andⅢ.MT is widely involved in many critical activities in the central nervous system，such as neuronal growth，autodefensive reaction，immune-regulation，and repair of cerebral injury.MT exerts many important biological functions like scavenging of free radicals，regulation of ion homeostasis in brain cells，detoxification of heavy metals，anti-inflammation，and anti-apoptosis.Recently，MT has been increasingly shown to have protective effects against cerebral ischemia.MT promises to be an important target for prevention and/or treatment of cerebral ischemic disease.In this review，the expression and regulation characteristics，and the effect of cerebral ischemic stress on MT expression have been summarized，with focus on the neuroprotective effect of MT and its possible underlying mechanisms.

metallothionein；central nervous system；brain ischemia

PENG Shuang-qing，Tel:(010)66948462，E-mail:pengsq＠hotmail.com

R963

:A

:1000-3002(2014)06-0898-06

10.3867/j.issn.1000-3002.2014.06.013

Foundation item:The project supported by National Natural Science Foundation of China(81102424)；National Science and Technology Major Project(2009ZX09501-034)；and National Science and Technology Major Project (2012ZX09J12203)

2014-07-04 接受日期:2014-10-30)

(本文编辑:乔 虹)

国家自然科学基金(81102424)；国家科技重大专项(2009ZX09501-034)；国家科技重大专项(2012ZX09J12203)

郭家彬，男，博士，主要从事心脑血管药理毒理学与药物毒理学研究，E-mail:gjb321＠163.com

彭双清，Tel:(010)66948462，E-mail: pengsq＠hotmail.com