人喉癌细胞系的建系研究进展△

汤玮晶 陶磊

·综 述·

人喉癌细胞系的建系研究进展△

汤玮晶 陶磊

细胞系的建立可以详细分析肿瘤细胞的生物学、形态学、抗原性和细胞原性的特征。喉癌是头颈部最常见的恶性肿瘤之一，病理分型以鳞状细胞癌为主。本文就细胞培养、细胞系和细胞株的建立和保存，肿瘤细胞的体外培养、人喉癌细胞系的建系情况、建系方法、细胞系的主要特性和细胞系培养过程中存在的问题进行综述。

1 细胞系建立的研究背景

美国动物学家Ross Granville Harrison于1907年首次成功地在体外培养基(凝结的淋巴液)中培养了神经元，被称为“组织培养之父”。进入20世纪50年代后，细胞培养技术得到快速发展。如今，细胞培养已成为全世界有关生命科学与医学实验广为应用的技术之一[3]。

1.2 细胞系和细胞株[4]将从有机体得到的细胞在体外进行第1次培养，称之为原代培养，也叫初代培养。如果对原代培养物进行传代培养，此时的培养物就称为细胞系。通过选择或克隆化培养，从原代培养物或细胞系中获得的具有特殊遗传、生化性质或特异标记的细胞群称为细胞株。在实际运用中，细胞系和细胞株的概念常常被相互混淆。

1.3 细胞系(株)的保存[5]已经建立的细胞系(株)由作者自行管理不便于使用交流，同时还存在细胞易污染和丢失等弊病。建立细胞库(cell bank)，使已经建立的细胞系(株)能得到妥善保存，并方便各实验室交流使用。从20世纪60年代起，发达国家都先后建立细胞库保存各类细胞系(株)，其中美国典型培养物保存中心(American Type Culture Collection, ATCC)是现今世界最大的细胞库。

1.4 肿瘤细胞的体外培养 由于细胞培养是研究细胞分裂增殖活动的很好手段，因而也成为研究肿瘤细胞生物学特性、肿瘤发生及发展病理和肿瘤药物筛选等的重要技术[6]。体外培养的肿瘤细胞是研究细胞生物学特性、癌变机制和癌症治疗的良好生物学模型。由于从新鲜肿瘤组织中难以获得足够数量的细胞，因此建立细胞系可以提供大量细胞以满足实验要求。细胞系的建立可以详细分析肿瘤细胞的生物学、形态学、抗原性和细胞原性的特征[7]。

癌细胞在体外和体内一样具有无限生长和分化不全的特点，因此比正常细胞容易培养和建系。但由于培养技术上的限制，对肿瘤细胞的培养经历了漫长的困难时期。从20世纪50年代开始，抗生素、合成培养基和玻璃器皿等培养用品以及胰蛋白酶消化处理技术陆续被引进到体外培养领域，使得对人类恶性肿瘤细胞的培养进入了一个飞速发展时期。1952年，Scherer等[8]首先成功地建立了来源于宫颈癌细胞的HeLa细胞系，标志着世界上第一个细胞系的诞生。后来，人癌细胞系如口腔癌、喉癌和肺癌等细胞系相继被建立起来。

1.5 人喉癌细胞系的建系情况 喉癌是头颈部最常见的恶性肿瘤之一，我国喉癌的发生率有逐年上升的趋势，2003～2007年中国喉癌粗发病率为2.04/10万[9]。喉癌的病理分型以鳞状细胞癌(鳞癌)为主[10]。

早在20世纪50年代，国外就有了一些有关喉癌及其他头颈癌细胞系建系的报道。1955年Morre等[11]建立了来源于喉鳞癌的Hep-2细胞系及其他3个鳞癌细胞系。1978年，Krause等[12]从194例头颈部鳞癌患者的标本中建立了3个细胞系。到20世纪80年代后，有关头颈部鳞癌细胞系建立的文献报道逐渐增多。1981年Easty等[13]对36个临床患者手术切除的肿瘤组织进行分离培养，建立了10个人鳞癌细胞系，分别来自于舌部和喉部，命名为HN-1至HN-10，其中NH-2、4、8、10为来源于喉鳞癌。1988年Sacks等[14]建立了2例来源于未经治疗的头颈部鳞癌患者的细胞系。1997年Kim等[15]建立了9个来源于头颈部肿瘤的细胞系，其中AMC 1-8来源于鳞癌，AMC 9来源于腮腺的未分化癌。1999年，Ku等[16]建立了6个人喉鳞癌细胞系。2010年，Liebertz等[17]建立了一株新的头颈部鳞癌细胞系，命名为USC-HN1。

正如问题描述的那样，我们有10万大小的训练集和10万大小的测试集。在此基础上，可以对有标签的训练数据集采用各种算法(如 Logistic、Adaboost、Randomforst 等)，通过调整算法参数和过采样策略，生成大量模型，分别对测试数据集进行预测。

目前国内用于喉癌研究的主要是Hep-2细胞系及裸鼠移植瘤细胞系，但有文献报道Hep-2已被HeLa细胞污染[14]。我国在21世纪初开始有自行建立喉癌细胞系的报道，马丽晶等[7]应用体外培养技术对24例喉鳞癌组织进行培养，1例获得成功，建立了命名为LSC-1的细胞系。蔡萍等[18]为了便于体外深入研究无人乳头瘤病毒(HPV)感染的喉癌发生、发展规律及HPV与喉癌演进的关系，通过裸鼠皮下移植瘤建立了1株HPV阴性的喉鳞状细胞癌细胞系，命名为Lsc-02。任乐荣等[19]取喉癌患者原发病灶和淋巴结转移组织，用组织块培养法进行原代培养，建立了2个人喉癌细胞系，分别命名为CCC-HLS和CCC-HLSLN。

2 人喉癌细胞系的建系方法

2.1 细胞系的标本来源 主要来源于临床喉癌患者活检或手术切除的标本，亦有使用局部转移淋巴结作为细胞系的标本来源。标本病理为鳞癌。

2.2 细胞系的建系过程 常采用常规组织块培养法或胶原酶消化法，成纤维细胞的清除采用酶消化法或反复贴壁法等[20]。

此外，亦有采用裸鼠皮下移植瘤的方法建立细胞系[21]。由于体外肿瘤细胞系建系较困难，裸鼠的过渡以及促细胞生长因子的运用可增强肿瘤细胞的活力，使得早期传代细胞顺利越过危险期从而长期传代[18]。

3 人喉癌细胞系的主要特性及鉴定

3.1 细胞形态学观察[10]在相差倒置显微镜下，活细胞为上皮细胞样形态，呈梭形或多边形，似铺路石样排列，可重叠生长。HE染色可见细胞具有高度的异型性，细胞形态及大小不一致；核呈多形性，大小、形态及染色不一致，部分胞核浆比例增大(接近1∶1)，核仁肥大，数目增多，核分裂象增多，出现不对称、多极性等病理性核分裂，偶见巨核细胞。

扫描电镜见细胞表面有大量的微绒毛及突起，新生细胞呈圆形。透射电镜下可见细胞核明显增大，核膜可有内陷或外凸，核的形态不规则，核异染质增多，凝集成块状或聚集在核膜下；核仁增大，数目增多，形态和位置不规则。胞质中可见张力原纤维，显示出鳞癌的特征。

角蛋白存在于正常复层鳞状上皮细胞、培养细胞及大部分来源于复层鳞状上皮的肿瘤细胞[22]，故细胞角蛋白免疫细胞化学染色为阳性可证实细胞来源于上皮细胞。

3.2 细胞生长动力学 通过测定绘制细胞生长曲线，计算细胞贴壁率以及软琼脂细胞克隆形成试验等判断细胞的生长情况。

3.3 细胞生物学性状的鉴定核型分析 可见细胞染色体有缺失、断裂、易位等结构异常[23]。此外，亦有细胞周期分析，基因突变检测等[16]。

3.4 裸鼠移植成瘤[7]细胞接种裸鼠后，处死裸鼠后取下肿瘤。大体形态观察：肿瘤为多发或单发，实性，包膜完整，包膜表面有丰富的血管，切面白色，质脆，中心有坏死液化；病理组织学证实为鳞癌，分化较差，其形态与原肿瘤相似。

3.5 细胞系污染情况鉴定[24]主要检查是否有支原体污染，多数细胞受支原体污染后无明显变化，仍能生长，故需及时鉴别处理。常用荧光染色法观察，荧光显微镜下支原体呈绿色小点，散在于细胞周围或附于细胞表面。若细胞被支原体污染，早期可采用添加抗生素或使用支原体特异性血清去除。做好预防工作比污染后再用药效果好。

3.6 其他[15-17]一些细胞系亦进行了EB病毒(EBV)、HPV等的筛选，白细胞分化抗原(CD)、细胞因子(CK)等细胞表面分子标记物的检测以及Notch1蛋白水平的测定等。

4 人喉癌细胞系建系过程中存在的问题

许多已建立的细胞系尚未达到永生化，有关细胞系的药物敏感实验及细胞表面分子表达情况的研究尚未进行，仍需进一步深入研究[7]。此外，长期培养可使细胞生物学特性发生改变；建系过程中可能受到各种污染，如微生物尤其是支原体的污染、来自同一患者的非恶性细胞污染以及细胞系间的交叉污染等[24]。

[ 1 ] Okamoto T,Sato JD,Barnes DW, et al. Biomedical advances from tissue culture[J].Cytotechnology, 2013,65(6): 967-971.

[ 2 ] 元英进.细胞培养工程[M].北京：高等教育出版社, 2012:33.

[ 3 ] 章静波.组织和细胞培养技术[M].北京：人民卫生出版社,2011:1-3.

[ 4 ] 薛庆善.体外培养的原理与技术[M].北京：科学出版社,2001:229-230.

[ 5 ] Stacey GN,Masters JR.Cryopreservation and banking of mammalian cell lines[J].Nat Protoc,2008,3(12):1981-1989.

[ 6 ] Xu W,HuX,PanW.Tissue engineering concept in the research of the tumor biology[J].Technol Cancer Res Treat, 2014, 13(2): 149-159.

[ 7 ] 马丽晶,韩德民,张伟,等.喉癌细胞系LSC-1的建立及生物学特性的初步研究[J].耳鼻咽喉-头颈外科,2002,9:295-298.

[ 8 ] Scherer WF, Syverton JT, Gey GO. Studies on the propagationinvitroof poliomyelitis viruses. Ⅳ. Viral multiplication in a stable strain of human malignant epithelial cells (strain HeLa) derived from an epidermoid carcinoma of the cervix[J]. Exp Med, 1953,97(5): 695-710.

[ 9 ] 杜灵彬,毛伟敏,陈万青，等.中国2003-2007年喉癌发病率和死亡率分析[J].中华流行病学杂志,2012,33(7):395-398.

[10] Busquets JM, Garcia HA, Trinidad-Pinedo J, et al. Clinicopathologic characteristics of head and neck squamous cell carcinoma in Puerto Ricans[J].P R Health Sci J,2003,22(3):259-264.

[11] Morre AE,Sabachewsky L,Toolan HW.Culture characteristics of four permanent lines of human cancer cells[J].Cancer Res,1995,15(9):598-602.

[12] Krause CJ, Carey TE, Ott RW, et al. Human squamous cell carcinoma. Establishment and characterization of new permanent cell lines[J]. Arch Otolaryngol,1981,107(11):703-710.

[13] Easty DM, Easty GC, Carter RL, et al. Ten human carcinoma cell lines derived from squamous carcinomas of the head and neck[J]. Br J Cancer,1981,43(6):772-785.

[14] Sacks PG, Parnes SM, Gallick GE, et al. Establishment and characterization of two new squamous cell carcinoma cell lines derived from tumors of the head and neck[J]. Cancer Res,1988,48(10):2858-2866.

[15] Kim SY, Chu KC,Lee HR, et al. Establishment and characterization of nine new head and neck cancer cell lines[J].Acta Otolaryngol,1997,117(5):775-784.

[16] Ku JL, Kim WH, Lee JH, et al. Establishment and characterization of human laryngeal squamous cell carcinoma cell lines[J].Laryngoscope,1999,109(6):976-982.

[17] Liebertz DJ, Lechner MG, Masood R, et al. Establishment and characterization of a novel head and neck squamous cell carcinoma cell line USC-HN1[J]. Head Neck Oncol,2010,2(5):1-14.

[18] 蔡萍,吴展元,李金荣,等.人乳头瘤病毒阴性的喉鳞癌细胞系的建立[J].中华病理学杂志,2005,34(8):533-536.

[19] 任乐荣,刘玉琴,李正江,等.人喉癌细胞系的建立及生物学特性研究[J].首都医科大学学报,2006,27(5):612-615.

[20] Freshmey RI. Primary culture of animal cells: a manual of basic technique[M]. 4th. New York:Wiley,2000:180-207.

[21] Tang JC, Wan TS, Wong N, et al. Establishment and characterization of a new xenograft-derived human esophageal squamous cell carcinoma cell line SLMT-1 of Chinese origin[J]. Cancer Genet Cylogenel,2001,124(1):36-41.

[22] Morifuji M, Taniguchi S, Sakai H, et al. Differential expression of cytokeratin after orthotopic implantation of newly established human tongue cancer cell lines of defined metastatic ability[J].Am J Pathol,2000,156(4):1317-1326.

[23] Jin C, Jin Y, Wennerberg J, et al. Nonrandom pattern of cytogenetic abnormalities in squamous cell carcinoma of the larynx[J]. Genes Chromo Cancer,2000,28(1):66-67.

[24] 杨吉成,宋礼华,周建华,等.医用细胞工程[M].上海：上海交通大学出版社,2003,6:92.

(本文编辑 杨美琴)

国家自然基金青年基金(30801283)；上海市科委青年科技启明星(09QA1401000)；上海市卫生局优青计划(XYQ2011055)

复旦大学附属眼耳鼻喉科医院耳鼻喉科 上海 200031

陶磊(Email: doctortaolei@163.com)

2013-07-16)