绵羊冷冻精液研究进展

陈世伟，权　凯，张兆旺

（1.甘肃农业大学动物科技学院，兰州730070；2.河南牧业经济学院，郑州 450000）

绵羊冷冻精液研究进展

陈世伟1，权凯2，张兆旺2

（1.甘肃农业大学动物科技学院，兰州730070；2.河南牧业经济学院，郑州 450000）

随着肉羊产业化、工厂化的发展，冷冻精液人工授精技术亟待应用于生产中。绵羊精液冷冻保存技术虽然得到了快速发展，但目前仍处在试验研究或小范围的应用阶段。因此，绵羊精液冷冻技术还需要深入、系统的研究。文章从绵羊精液冷冻保存稀释液中的添加剂、冷冻速率、冷冻-解冻对绵羊冷冻精液品质的影响，精液输精对受胎率的影响等方面进行了综述，为精液冷冻保存研究提供一定参考。

绵羊；冷冻精液；添加剂；受胎率

绵羊精液冷冻保存技术对绵羊人工授精、育种和遗传资源保护方面具有重大意义。自从1949年，Polge等发现了甘油的冷冻保护特性后，家畜冷冻精液研究和应用得到迅速的发展，尤其是在乳牛上的应用效果已同鲜精无明显差异。然而该技术在羊的应用方面依然受到很大的限制。目前，绵羊冷冻精液人工授精情期受胎率低的问题仍然没有得到解决。本文对绵羊精液冷冻保存方面的最新研究进展加以综述，旨在对今后精液冷冻保存研究工作提供一定的参考。

1　稀释液中添加剂对绵羊冷冻精液品质的影响

1.1冷冻精液稀释液中添加维生素对绵羊冷冻精液品质的影响

绵羊冷冻精液稀释液中添加一些维生素，对冷冻保存的精液品质有一定提高作用。罗海玲等［1］研究发现，添加维生素E可降低冷冻对精子顶体的损害程度，提高精液品质。古兰白尔·木合塔尔等［2］在和田羊精液冷冻稀释液中添加不同浓度的维生素E，发现添加量为1.2 mg/mL时精子解冻后活率（43.56%）显著高于对照组（34.14%）和其他各添加组（P＜0.05）。说明在冷冻精液稀释液中添加适当浓度维生素E可减缓冷冻对精子的伤害，提高冷冻-解冻后精子活率，改善冷冻精液品质。

哈福等［3］研究表明，在绵羊冻精稀释液中添加复合维生素B可有效提高冻精解冻后活率并保护精子形态结构的完整性。陈亚明［4］发现，VE、VB6和VB12能显著提高冷冻-解冻精子的活率，VE和VB6对解冻精子顶体保护效果较好，能提高精子的生存指数，并且VE、VB6和VB12有降低精浆中GOT、LDH和ALP活性释放量的作用。说明冷冻精液稀释液中添加维生素对精子有一定的保护作用。

1.2冷冻保护剂对绵羊冷冻精液品质的影响

冷冻精液中添加不同的冷冻保护剂，同一保护剂不同量对绵羊冷冻精液品质有一定影响。研究表明，用乙二醇作为冷冻保护剂解冻后的活力较高，效果显著，达0.43±0.028，并且在冷冻稀释液中添加了EDTA和Tris对精子有良好的保护性［5］。王立强等［6］将6%甘油作为小尾寒羊冷冻精液保护剂效果较理想。程彩虹等［7］发现，冷冻稀释液中添加5.0 mmol/L的半胱氨酸可有效保护精子免受过氧化物的损害。龙翔等［8］对不同冷冻保护剂在猪精液冷冻中的作用分析后发现，在常温下对精子毒害作用最大的是DMSO，其次是甘油，EG和DMA对精子毒害作用最小，但这些物质对绵羊精液的毒性试验报道较少，还有待进一步试验。

各种冷冻保护剂虽能在冷冻过程中起到保护作用，在精液冷冻稀释液中添加甘油、乙二醇等冷冻保护物质可以减少精子在冷冻过程中受到的损伤，同时，这些冷冻保护剂又有不同程度的毒害作用，对精子存在一定的毒性作用。因此，选择适宜的冷冻保护剂和最佳的添加量，对精液的冷冻保存效果有直接的影响。从目前研究现状来看，甘油、乙二醇依然是精液冷冻保存的首选，6%甘油添加剂量应用最多。

2　pH值和渗透压对绵羊冷冻精液品质的影响

稀释液的pH值和渗透压是影响精液保存效果的主要因素之一。张建军等［9］研究发现，稀释液中基础液pH值为7.2时精液冷冻效果最好，精子在pH值为6.6～6.8时运动比较旺盛，能量消耗过快，导致平衡解冻后精子活力较低，因此，pH值高于6.8时，精液冷冻效果较好。刘福元等［10］研究了萨福克羊精液低温液态保存效果时发现，当稀释液pH值接近绵羊精液pH值（7.0～7.2）时，保存效果最好。

刘福元等［10］发现，稀释液的渗透压为340 mOsm/L时，精子有效存活时间、存活时间和生存指数最高，以渗透压358 mOsm/L为标准，稀释液的渗透压越接近于绵羊精液的渗透压，保存效果越好。张兆旺等［11］在低温下保存鸡的精液时也发现，稀释液的渗透压和鸡精液的渗透压一致时精子的保存效果最佳。说明只有使精细胞处在一个相对稳定、适宜的环境中，其代谢才能正常进行，绵羊冷冻精液稀释液的渗透压为358 mOsm/L，与绵羊精液的渗透压一致时，冷冻保存效果最好。

3　冷冻速率对绵羊冷冻精液品质的影响

3.1平衡方法对绵羊精子冷冻后活率的影响

不同平衡方法对精子活率及生存指数有明显影响。陈亚明等［12］发现，应用200 mL38℃体积水浴2.5 h降温到4℃的平衡方法对冷冻精子的活率、生存指数、顶体完整率（P＜0.05）提高明显。于明举等［13］研究表明，平衡时间对解冻后综合指数影响差异显著（P＜0.05），平衡4 h效果优于1 h和2 h。赵有璋等［14］对绵山羊颗粒冻精品质优化试验后得出，优化的冷冻工艺是1:2稀释，4 h降温，滴冻成0.2 mL大小的颗粒，37℃VB12解冻。邓雯等［15］发现，精液冷冻水浴平衡降温速率前30 min，降温速率应控制在0.73～0.74℃/min之间，30～90 min降温速率应控制在0.11～0.12℃/min之间；并且250 mL水浴平衡时的降温时间3 h时对精子造成的冷打击最小，制作的冻精解冻后的精子品质最高。由此看出，200～250 mL水浴平衡2.5～4 h时可以在一定程度上提高精液品质。

3.2初冻温度对绵羊精子冷冻后活率的影响

初冻温度是影响精子冷冻后活率的一个重要因素。赖彦等［16］通过液氮熏蒸将初冻温度控制在-80℃可以使绵羊情期受胎率提高0.9～1.7个百分点。吴云海等［17］采用初冻温度为-120℃，入氮温度为-110℃的冷冻方法进行荷斯坦种公牛精液细管的冷冻，能明显提高冻后精子的活力，缩短制冻时间，提高工作效率。张晓霞等［18］发现，牛细管冷冻精液的最佳始冻温区为-84～-112℃。由此可见，选择一个好的初冻温度是精液是否能够冷冻成功的重要因素之一。对于绵羊精液冷冻最佳的初冻温度，还需进一步试验。

4　冷冻-解冻对绵羊冷冻精液品质的影响

不同解冻方式、解冻温度和解冻液对绵羊颗粒冷冻精液品质都有影响。张子军等［19］发现，在管壁薄、颗粒数多、湿解冻、水浴温度42～45℃和VB12解冻液条件下解冻后效果较好。哈福等［20］表明，不同解冻温度对精子活力有极显著影响，在42℃解冻的精子解冻后活力最高，达0.40±0.02。徐振军等［21］的研究结果表明，从液氮中取出细管精液，迅速投入39～40℃水浴中，停留10～15 s取出，解冻后活率最高达0.53。说明在冷冻精液解冻过程中，解冻温度为40～42℃以及必要时采用维生素B12解冻液对提高绵羊冷冻精液品质具有重要作用。

5　绵羊冷冻精液输精方法对受胎率的影响

输精方法对绵羊冻精人工授精受胎率有直接的影响。刘桂娟［22］研究表明，绵羊腹腔镜子宫内冷冻精液输精的情期受胎率68.90%，要远远高于阴道子宫颈口输精的情期受胎率32.97%，两种方法输精效果差异极显著（P＜0.01）；并且绵羊情期每只输精总次数与年份因素对绵羊冷冻精液人工授精的受胎率没有显著影响（P＜0.05）。李焕玲等［23］研究了不同输精方法和输精次数对绵羊冷冻精液受精率的影响后发现，子宫角输精法情期受胎率（59.32%）比过颈输精法（42.31%）提高17.01个百分点，差异极显著（P＜0.01）；输精3次的受胎率（33.33%）比输精2次的受胎率（27.78%）提高5.55个百分点，差异显著（P＜0.05）。石国庆等做了绵羊腹腔内窥镜子宫角深部冷冻精液输精试验后发现，采用人用黄体酮、PMSG对绵羊进行同期发情处理，46只绵羊48 h同期发情率95.65%（44/46），用解冻后活力仅0.2的冷冻精液，借助腹腔内窥镜子宫角深部输精，情期受胎率72.73%（32/44），与常规冷冻精液输精的情期受胎率55.45%（178/321）相比，高出17.78个百分点，差异极显著（P＜0.01）。卢景郁等［24］对绵羊冷冻精液进行深部输精后发现，在发情后24～36 h输精2次，间隔8～12 h，可提高冻精受胎率。表明腹腔镜输精子宫内的受胎率要远远高于其他输精方式的受胎率。目前，腹腔镜输精已广泛应用于人工授精技术当中，并获得了良好的受胎率。

6　其他因素对绵羊冷冻精液人工授精的影响

另外，品种、饲养管理水平、输精时间、输精剂量等均对绵羊冷冻精液人工授精技术有一定影响。刘玉峰等［25］对绵羊不同发情方式的不同输精时间进行研究证明，自然发情、诱导发情、同期发情的绵羊子宫颈口输精在发情后24 h内输精效果较好。诱导发情与同期发情母羊的腹腔镜输精，应该在撤栓后54 h与60 h进行，受胎效果较好。发情母羊子宫内输精的输精范围应该在发情结束前2～3 h，也就是排卵前2～3 h，输精效果较好。有研究表明，绵羊不同的膘情体况、年龄、胎次、输精方式、季节、产羔后再次输精间隔时间、输精人员、公羊等相关因素也会影响阴道子宫颈口与腹腔镜子宫内输精效果（P＜0.05），且呈显著相关性［22］。不同品种的公羊精液品质也不尽相同。杨凌等［26］研究了绵羊不同品种细管冷冻精液试验后发现，细管冻精解冻后活率以黑萨福克羊活率最高，与杜泊羊和特克塞尔羊相比差异显著（P＜0.05），其他品种之间相比差异不显著（P＞0.05）。后来发现绵羊冻精品质与其在当地的适应性有一定的相关性。

冷冻精液（特别是颗粒精液）解冻时，要严格按照操作规程进行，解冻后一定要镜检，精子活力达0.3以上才能输精。母羊发情排卵要求对母羊进行合理的饲养管理，维持其适当的膘情，对于有生殖疾病的母羊要及时检查治疗。改善生活环境，给予适当的户外活动和光照，对母羊的发情排卵、受精和妊娠是重要的。清洁消毒时不要造成精液污染，输精枪和开膣器用完后，要用酒精灯火焰消毒，再用生理盐水棉球擦净晾干 （冯国权等，2002）。

［1］罗海玲，贾志海，朱士恩，等.稀释液中添加维生素E对绵羊冷冻精液品质的影响［J］.中国畜牧杂志，2004（11）：9-11，52.

［2］古兰白尔·木合塔尔,吴海荣，艾合买提江·吐尔逊，等.稀释液中添加维生素E对和田羊冷冻精液品质的影响［J］.黑龙江动物繁殖，2013（1）：9-11.

［3］哈福，赵有璋.绵羊冷冻精液稀释液中添加复合维生素B提高冻精解冻后品质的研究［J］.甘肃农业大学学报，2003（1）：17-19，46.

［4］陈亚明.绵羊精液超低温冷冻程序及稀释液优化方法的研究［D］.兰州：甘肃农业大学，2002.

［5］乌兰托娅.绵羊细管冷冻精液稀释液的研究［D］.呼和浩特：内蒙古农业大学，2010.

［6］王立强，陈辉，马健.小尾寒羊精液冷冻技术研究［J］.畜牧兽医杂志，2004（1）：11-13.

［7］程彩虹，岳文斌，任有蛇，等.稀释液中添加半胱氨酸对绵羊冷冻精液品质的影响［J］.中国草食动物，2012，32（1）：29-31.

［8］龙翔，邰秀林.不同冷冻保护剂在猪精液冷冻中的作用分析［J］.畜禽业，1999（9）：18-19.

［9］张建军，杨军祥，苟想珍，等.绵羊精子的生物学特性及其不同因素对精子活力的影响［J］.当代畜牧，2007（12）：29-31.

［10］刘福元，陈玲香，杨永林，等.萨福克羊精液低温液态保存效果的研究［J］.安徽农业科学，2008（25）：10887-10889.

［11］张兆旺，刘丽霞.稀释液溶质、渗透压、pH值和缓冲指数与低温保存鸡精液效果的关系［J］.中国家禽，2004（21）：13-16.

［12］陈亚明，赵有璋.绵羊冷冻精液平衡方法研究［J］.甘肃农业大学学报，2002（3）：346-350.

［13］于明举，王岭斌，罗艳梅，等.山羊夏季精液品质分析及冷冻方法优化［J］.中国畜牧杂志，2009（17）：19-22.

［14］赵有璋，陈亚明，孙照刚，等.提高绵、山羊颗粒冻精品质的研究［J］.中国草食动物，2003，23（1）：3-5.

［15］邓雯，禹学礼，庞有志，等.绵羊精液平衡过程中降温速率对精子品质的影响［J］.中国畜牧兽医，2010（4）：109-112.

［16］赖彦，刘丽娜，吕潇潇，等.道赛特绵羊细管冷冻精液商品化研究［J］.黑龙江畜牧兽医，2010（20）：65-67.

［17］吴云海，马亚宾，刘廷玉，等.两种不同冷冻方法对荷斯坦种公牛细管冻精活力的影响［J］.今日畜牧兽医，2006（7）：7-8.

［18］张晓霞，吴庆荣，张海涛，等.应用混沌、孤立子理论验证微型细管牛冷冻精液最佳始冻温区［C］//第六届全国低温生物医学及器械学术大会论文集.北京：中国制冷学会第六专业委员会，2009：5.

［19］张子军，赵有璋.不同解冻方式、解冻温度和解冻液对绵羊颗粒冷冻精液品质的影响［J］.中国草食动物，2005，25（1）：61.

［20］哈福，赵有璋.在绵羊冷冻精液解冻液中添加复合VB提高冻精解冻后品质的研究［J］.中国草食动物，2003，23（5）：19-20.

［21］徐振军，闫长亮，郭成，等.小尾寒羊精液保存技术研究［J］．中国畜牧杂志，2006，42（21）：9-11．

［22］刘桂娟.绵羊冷冻精液人工授精及影响受胎率相关因素的研究［D］.沈阳：东北农业大学，2009.

［23］李焕玲，王金文，王德芹，等.不同输精方法和输精次数对绵羊冷冻精液受精率的影响［J］.当代畜牧，2006（4）：26-27.

［24］卢景郁，黄贺，田亚光，等.绵羊冷冻精液深部输精效果观察［J］.黑龙江动物繁殖，2005（4）：44.

［25］刘玉峰.绵羊子宫内输精技术的研究［D］.沈阳：东北农业大学，2003.

［26］杨凌，张乐颖，王贵江，等.绵羊不同品种细管冷冻精液试验［J］.西北农业学报，2006（6）：28-30.

Recent Advances in Sheep Semen Cryopreservation

Chen Shiwei1，Quan Kai2，ZhangZhaowang2
（1.College ofAnimal Science and Technology，Gansu Agricultural University，Lanzhou 730070，China；2.Henan UniversityofAnimal Husbandryand Economy，Zhengzhou 450000，China）

With the development ofmutton-sheep industrialization，the application ofartificial insemination with frozen semen became urgent.Although there was a rapid development in the sheep frozen-semen storage technology，it was still in the stage ofexperiment or application in a small scale.Therefore，sheep frozen-semen technologyalsoneed tobe researched in depth systematically.In this paper，the effect ofdilute additive，freezingrate and frozen-thawed on sheep frozen semen and the effect of artificial insemination on the conception rates ofsheep were discussed，in order toprovide a reference for further study.

sheep；frozen semen；additive；conception rate

S826.3

A

2095-3887（2014）06-0056-03

10.3969/j.issn.2095-3887.2014.06.017

2014-09-03

陈世伟（1989-），男，硕士研究生。

权凯（1977-），男，博士。研究方向：动物繁殖与肉羊生产。