CD39在转化医学中的作用

张 波，张 杰，谭 涛，张 灏，朱 骅

CD39在转化医学中的作用

张 波，张 杰，谭 涛，张 灏，朱 骅

CD39／膜外三磷酸腺苷二磷酸水解酶-1是一个细胞膜整合的跨膜结构，细胞外有核苷脱磷酸化作用的结合区域的糖蛋白酶，其表达于细胞膜外表面，能使细胞外三磷酸腺苷、二磷酸腺苷水解为磷酸腺苷。目前，研究发现CD39在多器官缺血再灌注损失、血栓形成、器官移植排除反应、肿瘤发生等疾病中起着重要作用，并且在以上疾病中的表现存在交叉作用和共同作用。

膜外三磷酸腺苷二磷酸水解酶-1；三磷酸腺苷；腺苷，缺血再灌注；血栓；移植排斥；抗肿瘤

CD39作为一种跨膜水解酶，在多种生理病理过程中有重要作用。本文对国内外有关CD39的研究进展和现状作一综述，着重介绍CD39在多器官缺血再灌注、血栓形成、器官移植排斥以及肿瘤发生发展中的作用，希望全面展示CD39在转化医学不同领域中的应用和前景。

1 CD39的基本结构和特征

CD39／膜外三磷酸腺苷二磷酸水解酶-1（ecto-nucleoside triphosphate diphosphohydrolase，ENTPDase-1）是一个细胞膜整合的跨膜结构，细胞外有核苷脱磷酸化作用的结合区域的糖蛋白酶，其表达于细胞膜外表面，能使细胞外三磷酸腺苷（adenosine triphosphate，ATP）、二磷酸腺苷（adenosine diphosphate， ADP）水解为磷酸腺苷（adenosine monophosphate，AMP）［1］，而且CD39水解核苷酸有很高的转化率，转化ATP成AMP而没有ADP的释放。CD39有6个可能的N-糖基化的位点，它们的缺失和表达对CD39的酶活性作用会产生影响。在质膜中，CD39以低聚体形式存在，这有利于发挥其酶的作用。CD39完整的N-糖基化是其发生酶性作用的前提［2］。CD39激活A1、A3腺苷酸受体（adenosine receptors，ARs）通过蛋白酶C和线粒体的ATP敏感性钾通道（ATP-sensitve potassium channel，KATP）以保护心脏和其他的组织［3］。A2A受体通过阻止中性粒细胞、血小板、巨噬细胞、T细胞中的炎性因子的释放来减轻再灌注的损伤［4］。炎症反应中腺苷酸产生的受体在不同的物种中有不同的表现，如A3／A2B主要在啮齿类动物、猪以及人等体内表现。

CD39酶家族共有8个，CD39／ENTPDase-1～CD39／ENTPDase-8。CD39／ENTPDase-1可水解ATP和ADP为腺苷，其在内皮细胞和血管平滑肌细胞中表达较强，在血小板和红细胞中表达较弱。CD39位于膜表面小凹，最近的数据表明在胆固醇丰富的膜表面CD39活性和功能与血栓形成有关联［5］，这提示临床是否可应用于凝血功能障碍和动脉粥样硬化的治疗。

CD39被证实为EB病毒（Epstein-Barr virus，EBV）引起的类淋巴母细胞的表面标志物［6］，可出现在激活的免疫细胞表面，如CD39表达于激活的B细胞、自然杀伤细胞、T细胞、血管内皮细胞、巨噬细胞、树突状细胞膜。在原始的神经细胞、星型胶质细胞膜也可以见CD39的表达。CD39能抑制ADP诱导的血小板聚集，CD39基因敲除实验进一步证实了CD39参与了血小板的聚集相关的ADP依赖的P2Y1受体的调控［7］。CD39基因敲除老鼠中单核细胞和巨噬细胞的趋化作用也受到影响。

可以看出，CD39在缺血再灌注损伤保护、血栓形成、免疫平衡等方面的作用机制上有交叉之处。

2 CD39在各领域的生物学作用研究

2.1 CD39在缺血再灌注损伤保护中的作用 缺血再灌注损伤普遍存在于休克、血栓再通、器官移植等，其涉及缺血缺氧造成的机体组织细胞能量代谢不足，而引起组织细胞坏死；在再灌注发生后，缺血部位的炎性细胞、细胞因子的大量释放，可造成组织细胞的再次损伤［8］。所以，对缺血再灌注损伤的防治主要是减少缺血造成的组织细胞损伤及缓解再灌注后的大量细胞因子、自由基等对组织细胞造成的进一步损伤。

CD39是一个依赖钙、镁离子的ATP双磷酸酶，其和ATP、ADP的结合能力相当，能促进ATP和ADP水解为AMP和磷酸，同时释放能量。细胞外的核苷酸包括ATP、ADP、三磷酸尿苷（uridine 5′-triphosphate，UTP）、二磷酸尿苷（uridine diphosphate，UDP），它们可以由白细胞、内皮细胞和血小板释放，可以提供很简单但是无处不在的信号通路（主要通过血管体现）。这些递质结合多种在血小板、内皮细胞、血管平滑肌细胞、白细胞上表达的P2型受体。大约有15种P2受体参加细胞外核苷酸传输细胞信号，触发和调节血管细胞和免疫细胞的代谢、一氧化氮（nitric oxide，NO）释放、结合、激活、转移、增殖和凋亡。CD39在缺血预处理中的下游机制：通过CD39-CD73（5′核苷酸酶）-腺苷受体激活进而激活磷酯酰肌醇3激酶／蛋白激酶B信号通道，磷酸化抑制糖元合成酶激酶-3β（glycogen synthase kinase-3 beta，GSK-3β），开放KATP，保护线粒体功能。其中，GSK-3β是多条通路的汇聚点，在缺血再灌注中具有重要的作用。此外，Wnt信号通路也可以通过影响GSK-3β对上述环路产生影响，并通过哺乳动物雷帕霉素靶蛋白保护心肌。Cai等［9］证实了心肌过表达CD39可以激活蛋白激酶B、细胞外调节蛋白激酶1／2等通路，进而磷酸化抑制GSK-3β通路，减低线粒体膜通透性转换孔开放最终保护心肌。

CD39在血管内皮和心脏的表达使其在缺血期间能产生有益的作用。细胞外的嘌呤代谢主要由CD39／ENTPDase-1介导，使ATP、ADP转化成AMP和磷酸并释放能量。AMP在CD73的作用下转化为具有保护作用和抗炎作用的腺苷［10］。Crikis等［11］也报道CD39对肾脏缺血再灌注的保护作用。

2.2 CD39在血栓形成中的作用 目前认为细胞调节血小板活性主要通过4个方面，即CD39、血栓素A2（thromboxane A2，TXA2）、前列环素I2（prostaglandin I2，PG I2）和NO。过去一直认为，抑制血小板活性主要通过内皮细胞产生花生四烯酸类物质或NO阻止活化血小板生成血栓素。但在对嘌呤信号途径研究中发现，血小板P2Y12受体和P2Y1受体主要负责ADP介导的血小板反应，而P2Y12受体主要在血管内皮细胞中表达［12］。关于P2Y12受体的实验假设是内皮细胞产生的花生四烯酸类物质和NO抑制血小板激活，于是用阿司匹林和放射性标志的ADP作用人脐静脉内皮细胞，同时阻止其PG I2／D2的形成及NO产生［13］。但是研究发现，用阿司匹林和ADP作用的内皮细胞上清液不再能诱导血浆血小板在内皮细胞聚集［14］。这意味着内皮细胞CD39水解ADP，从而明确其可抑制血小板激活。

CD39不是直接作用于血小板，而是通过消除血小板的补充间接影响来产生作用。因此，可以推测可溶性的CD39可以在血液循环中起到抗血小板的作用［15］。在猪和鼠的实验中证明了可溶性的CD39阻止了血小板的急性慢性聚集［16］。可溶性的CD39通过消除细胞膜上附着固有蛋白的N-和C-的跨膜区域来得到。通过抗体的结合部位和一致性的分析，CD39的主要结合部位在细胞膜的外表面。细胞外核苷酸的代谢证实了CD39的酶性作用点是在细胞膜外。这也暗示了CD39不可能进入细胞基质。

细胞外的核苷酸通路已经被认为是介导免疫反应、血管炎症感染、血栓形成的重要递质。嘌呤信号通路在炎症中的表现主要由3个部分组成：①细胞外核苷酸的诱导和生成；②细胞分子转化特异性受体的表达；③外核苷酸酶通过水解核苷酸调节细胞内的反应。

介导细胞外核苷酸的细胞表面受体属于两个结构不同的家族，主要有P2Y和P2X，P2Y2克隆亚型已经得到，其他的也被证实存在［17］。根据受体和信号通路的组成，P2Y受体影响细胞的激活、增殖、诱导凋亡。虽然血小板的P2Y12受体在ADP介导的血栓形成临床实验中得到了证实，但最近有证据证明P2Y1、P2Y2受体在血管内皮细胞、平滑肌细胞、单核细胞介导的炎症反应中同样起着非常重要的作用［18］。和其他的G蛋白偶联受体一样，P2Y受体也受到其他对抗作用而造成不敏感化［19］。这些可能涉及多种蛋白酶引起的受体磷酸化作用，导致其受到抑制。

2.3 CD39在器官移植中的作用 移植手术虽然解决了器官功能衰竭的功能代偿问题，但移植手术造成了移植物的冷热缺血，紧接着产生的再灌注释放大量的氧化因子及术后排斥反应和免疫抑制后感染等一系列的病理变化。在供体的冷热缺血和再灌注损伤，以及随后的急性细胞排斥反应和远期的慢性移植物血管病中，主要涉及到缺血再灌注损伤、炎症因子、氧化活性物质的释放、血栓形成、免疫排斥反应等方面的问题。

在移植相关研究中，CD39除了对供体在冷热缺血和再灌注损伤具有保护作用外，对免疫平衡也有一定的调节作用。CD39组成性表达于人Foxp3＋Treg，在小鼠所有的CD4＋CD25＋T细胞表达［20］。CD39水解细胞外ATP或ADP成为AMP，AMP在CD73的作用下产生腺苷。这些核苷具有主要的抑制和抗增殖效应。CD39的表达由Treg特异性的转录因子Foxp3驱动，其催化活性被T细胞受体配体显著增强，活化的Treg细胞因此失去ATP相关的活性，如P2受体介导的细胞毒性和ATP驱动的树突状细胞成熟［21］。提示Treg另一种抗炎症反应的重要机制是催化失活和细胞外ATP在CD39作用下的转化。

在人体内对于Treg的分子信号通路仍然不是很明确。CD39高表达的Treg抑制了白介素（interleukin，IL）-17产生的能力［22］。免疫抑制机制是相互联系的，CD39＋的Treg消除了ATP，这主要依赖于细胞的毒性因子和成熟的树突状细胞。和小鼠体内不同的是，在人体内外周血中的Foxp3＋CD4＋T细胞包括Treg和非Treg。后者细胞表面缺失CD39的表达，也免疫分泌γ-干扰素（interferon-γ，IFN-γ）、IL-2、IL-7。

在肾脏移植中，移植物功能延迟恢复主要是由于慢性排斥反应和供体的缺血再灌注损伤造成，直接影响了患者的生存时间。缺血再灌注损伤涉及氧化因子的瀑布链的反应释放、炎性细胞及其多细胞间的交叉反应。有统计表明，移植物功能延迟恢复造成在移植后3.2年移植物失功的比例高达41%［23］。Lu［24］等对在缺血再灌注损伤中释放的核苷酸进行了深入的研究，阐明了CD39的高表达减轻了肾脏的缺血再灌注损伤。在热缺血和器官移植涉及到的冷缺血中，CD39的转基因高表达的肾脏保护作用明显。同时也证明在有CD39高表达的移植供体中能起到很明显的移植保护作用，当移植物再灌注到72 h，对提高受体的存活率的作用也很明显。实验表明，通过对抑制腺苷A2A受体，CD39的保护作用也被减弱［25］，故CD39对缺血再灌注损伤的保护作用主要是通过腺苷A2A受体介导的信号通路。因为CD39主要表达于白细胞和内皮细胞的表面，主要组织相容性复合体-Ⅰ分子促进了CD39在多细胞内的表达，虽然CD39在多系统内都有保护作用，但是这个不同于CD39在缺血再灌注和炎症时白细胞和内皮细胞内的释放。

2.4 CD39在肿瘤中的作用 ATP介导多种生理反应，在细胞的代谢中起着重要的作用，主要是生物供能的作用。细胞外的ATP主要是作用于P2受体，P2受体家族主要有7种即P2X1～7，以及8种P2Y G蛋白偶联的受体即P2Y1、P2Y2、P2Y4、P2Y6、P2Y11～14［1，26］。5种P2受体在抗肿瘤中参与作用，主要是P2X5、P2X7、P2Y1、P2Y2和P2Y11，但是这些受体具体的参与过程不清楚［27］。P2X7在黑色素瘤中表达，主要引起ATP诱导的细胞生长抑制和细胞死亡。肿瘤细胞和肝窦内皮细胞共培养发现CD39通过细胞外的ATP刺激产生内皮细胞的肿瘤杀死作用［28］。在ATP诱导的较弱的肿瘤抑制作用中，嘌呤机制是主要的表现，其表现：①坏死细胞和其周围受到杀死的细胞释放的危险信号；②消除细胞外肿瘤微坏境中的ATP后，内皮细胞表达的CD39加速了肿瘤的生长。

CD39在内皮细胞和调节性T细胞中表达很高。有人证明了CD39的缺失减慢了黑色素瘤的生长，同时抑制了血管的生成，从而减少了其转移的可能［29］。CD39在调节性T细胞抑制自然杀伤细胞抗肿瘤作用的同时，其也增加了肝脏转移性肿瘤的转移，但是血管中的CD39却增加了血管的生成。当ATP出现在细胞外的肿瘤微环境时，ATP很快就在CD39的作用下被水解为AMP［30］。因此，在CD39敲除后，造成肿瘤细胞中央快速生长坏死细胞释放的ATP不能被水解，进一步造成细胞外ATP的水平急剧升高，最后邻近的肿瘤细胞被杀死。从上可以看出，CD39通过抑制抗肿瘤的免疫反应和提高血管的生成来促进肿瘤生长和转移。

通过对乳腺癌患者血小板中CD39的分析，比较患者他莫西芬（三苯氧胺）的使用时间，结果显示他莫西芬的使用使ATP水解增加，ADP水解减少，但是AMP的水解没有变化［31］。在乳腺癌细胞中CD39的表达通过雌激素受体的作用起到负性调节作［32］。当雌激素受体表达下降，CD39升高，可以使和乳腺癌有关的核苷酸产生增加。核苷酸在肿瘤组织中聚集，刺激肿瘤的生长和血管的生成，阻止细胞因子的合成，抑制免疫细胞黏附到内皮，减弱T细胞、巨噬细胞、自然杀伤细胞。

Dzhandzhugazyan等［33］也证实了CD39的高表达和人高分化的黑色素瘤、肿瘤细胞在肿瘤进展早期逃脱细胞免疫杀死之间的联系，这也进一步说明了嘌呤在肿瘤分化中的重要性。Buffon［34］研究发现，256肿瘤细胞中CD39对细胞外腺嘌呤核苷酸／腺嘌呤核苷比值的调节，以此来影响肿瘤的生长。

CD39是一种广泛存在于各细胞表面的跨膜结构，其在缺血再灌注损伤、血栓形成、免疫平衡和肿瘤发展方面有重要作用。其在以上方面的作用机制已被逐渐阐明，CD39将成为临床上一个新的治疗靶点，有较高价值的应用前景。

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Biological roles of CD39 in translational medicine

ZHANG Bo1，ZHANG Jie1，TAN Tao1，ZHANG Hao2，ZHU Hua1
（1.Department of Surgery，Davis Heart and Lung Research Institute，The Ohio State University Wexner Medical Center，Columbus，OH 43210，USA；2.Cancer Research Center，Shantou University Medical College，Shantou Guangdong 515041，China）

Ectonucleoside triphosphate diphosphohydrolase 1（ENTPD-1，also known as CD39）is an integrated cell transmembrane protein，which can degrade extracellular adenosine triphosphate（ATP），adenosine diphosphate（ADP）and adenosine monophosphate（AMP）into adenosine.It is also a key regulator of purinergicmodulation.This review is focused on the important roles of CD39 in ischemia reperfusion injury tomultiple tissues，thrombosis，rejection reaction after organ transplation，tumor suppression，and cross-talk between these diseases.

CD39；Adenosine triphosphate（ATP）；Adenosine；Ischemia-reperfusion；Thrombosis；Graft rejection；Anti-tumor

Q556

A

2095-3097（2014）03-0180-05

10.3969／j.issn.2095-3097.2014.03.014

2014-03-06 本文编辑：卢婷婷）

American Heart Association（12SDG12070174）

Department of Surgery，Davis Heart and Lung Research Institute，The Ohio State University Wexner Medical Center，Columbus，OH 43210，USA（张 波，张 杰，谭 涛，朱 骅）；515041广东汕头，汕头大学医学院肿瘤研究中心（张 灏）

张 灏，E-mail：haozhang＠stu.edu.cn；朱 骅，E-mail：Hua.zhu＠osumc.edu