马拉色菌临床鉴定研究进展

尹斌 冉玉平

马拉色菌临床鉴定研究进展

尹斌 冉玉平

嗜脂性酵母马拉色菌属(Malassezia spp.)是人类和动物皮肤上的常驻菌群,由于生长依赖于脂质(厚皮马拉色菌除外),主要分布于皮脂丰富部位,如头皮、面部、胸背部,约占健康人皮肤定植真菌总量的50%～80%[1-2]。作为条件致病菌,马拉色菌与多种人及动物皮肤疾病相关,包括直接感染皮肤组织所致的花斑糠疹、马拉色菌毛囊炎;通过免疫机制参与某些疾病的发生发展,如,脂溢性皮炎、特应性皮炎、痤疮、甲真菌病、银屑病、包皮龟头炎、外耳道炎、融合性网状乳头瘤病等。抗真菌药物是治疗马拉色菌感染的主要手段,但不同种类马拉色菌对他克莫司、唑类等药物的敏感性不同[3-4],因而其分类鉴定的临床重要性日益显现。

一、马拉色菌的分类

1853年Robin从花斑糠疹患者皮损处培养分离出马拉色菌,但直到1889年Baillon才首次提出了马拉色菌(genusMalassezia)的概念。在其后的约一百年间,马拉色菌属的命名和分类非常混乱。1990年代,通过对各菌种形态学和生理生化学特性的研究,以及脉冲凝胶电泳(PFGE)、随机扩增多态性分析(RAPD)和核糖体RNA(rRNA)基因序列分析的应用,定义和命名了7种马拉色菌:糠秕马拉色菌(M.furfur)、合轴马拉色菌(M.sympodialis)、钝形马拉色菌(M.obtusa)、球形马拉色菌(M.globosa)、限制马拉色菌(M.restricta)、斯洛菲马拉色菌(M.slooffiae)和厚皮马拉色菌(M.pachydermatis)。自2002年起通过rRNA基因序列分析和限制性片段长度多态性(RFLP)等方法陆续发现了7种马拉色菌新种:皮肤马拉色菌(M.dermatis)、日本马拉色菌(M.japonica)、大和马拉色菌(M.yamatoensis)、纳娜马拉色菌(M.nana)、羊马拉色菌(M.caprae)、马马拉色菌(M.equina)和兔马拉色菌(M.cuniculi)[5]。目前,已发现上述14种马拉色菌中有11种参与人体皮肤微生态构成[6]。随着马拉色菌研究的不断进展,菌种分类体系的建立已深入至相关疾病与特定菌种之间关系的研究,其中重要一环是准确鉴定在皮肤表面分布的马拉色菌群(Malasseziamicrobiota)。

二、依赖于培养的马拉色菌鉴定方法

1.传统的形态生理生化鉴定:临床对酵母菌的鉴定主要是基于其生化特征,API20C AuxTM和ID 32C APITM(bioMérieux)是最常用的酵母菌鉴定商用试剂盒,能在48 h内分别鉴定47和69种酵母菌,但由于它们无法提供马拉色菌生长需要的脂质营养而不能用于马拉色菌的鉴别[7]。根据马拉色菌对脂源的同化、七叶苷分解、过氧化氢酶实验及形态学的不同,形成了一套形态学及生理生化鉴定系统[7],包括:①沙堡弱培养基(Sabouraud dextrose agar,SDA)生长试验;②改良Dixon培养基温度生长试验;③吐温20、40、60、80利用试验;④七叶苷分解试验(Esculin solution test);⑤过氧化氢酶试验(Catalase test);⑥PGE-35蓖麻油试验(Castor oil test)。该系统联合应用CHROMagarTM马拉色菌培养基可进一步提高鉴定准确性。Kaneko等[8]分析9种370株马拉色菌,有363株(98.1%)得以准确鉴定。Ramadán等[9]对200株花斑糠疹皮损区临床分离株进行鉴定,结果显示51%为合轴马拉色菌,40%为球形马拉色菌,随后为糠秕马拉色菌(7%)、钝形马拉色菌(1%)与斯洛菲马拉色菌(1%)。

随着分子生物技术的迅速发展,传统方法所固有的不足逐渐显现:马拉色菌菌种之间除球形马拉色菌外没有太多形态学特征可供鉴别;培养过程常被其他酵母菌污染,鉴定前必须反复多次划线纯化以获得单菌落;部分菌种生长缓慢(如球形、限制马拉色菌),易被生长较快的菌种(如糠秕马拉色菌)竞争性抑制;形态学和生化鉴定操作复杂,周期长,受培养方法及实验者主观判断影响较大,导致菌种分布情况在不同的研究报告中存在较大差异,尤其是在生化鉴定与分子生物学鉴定方法之间。

2.rRNA基因序列分析:真菌rRNA内转录间区(internal transcribed spacer，ITS)、5.8S rRNA 基因、D1/D2 26S rRNA 基因和基因间间隔1区(intergenic spacer region 1，IGS 1)随菌种不同而有所差异,而在种内其长度通常恒定,其中ITS区和D1/D2 26S rRNA基因被广泛用于真菌鉴定。对于马拉色菌属而言,同种间D1/D2 26S rRNA基因DNA相似性大于99%;而各马拉色菌菌种间ITS区的长度从161～266 bp不等,而且球形与限制马拉色菌还表现出种内的序列多样性[7]。很多种马拉色菌只需要进行D1/D2 26S rRNA基因测序即可鉴别,但合轴马拉色菌以及进化关系与其紧密相关的马、羊、皮肤马拉色菌除外。这4种马拉色菌的D1/D2 26S rRNA基因序列相似性超过98%～99%,其ITS1区和ITS2区的基因序列相似性分别为82%～93%和88%～95%。因此当菌株考虑为合轴以及与其紧密相关的马拉色菌时,推荐D1/D2 26S rRNA基因测序和ITS区基因测序联合进行。IGS区测序可用于马拉色菌,但适用于流行病学调查。根据IGS1区序列的变异,发现某些球形马拉色菌菌株对特应性皮炎可表现出一定程度的偏向性[10-11]。对限制马拉色菌的研究[12]也发现,来源于正常皮肤与来源于特应性皮炎的菌株,IGS1区序列具有明显的差异。

3.其他基于分子技术的鉴别方法:随机扩增多态性DNA可用于特定马拉色菌菌种的标记和基因图谱研究,有研究采用该方法对分离自花斑糠疹、脂溢性皮炎合并HIV的糠秕马拉色菌进行分型和相互比较[13]。应用扩增片段长度多态性(AFLP)和变性梯度凝胶电泳(DGGE)分析已成功鉴定出马拉色菌菌种和糠秕马拉色菌种内差异性[14]。采用限制性片段长度多态性分析(RFLP)对糠秕马拉色菌ITS2区进行分析,表明菌株具有明显的地理差异性,如从欧洲东南部分离的糠秕马拉色菌株,较自欧洲其他地方分离的菌株缺乏BanⅠ酶切位点,其差异具有统计学意义[15]。对厚皮马拉色菌的ITS1区及核糖体大亚基rRNA进行测序和单链构象多态性(SSCP)分析可将厚皮马拉色菌分为3个主要的基因簇,其中两个与皮损区皮肤和高磷脂酶活性有关[16],由此可分析马拉色菌生理特性和不同菌株的来源。

三、不依赖于培养的鉴别方法

准确地鉴定皮肤表面马拉色菌群要求待测标本中所有种类的马拉色菌均能在培养基中生长复苏,然而没有任何一种培养基能满足所有马拉色菌的生长要求。尽管依赖于培养的方法可以产出相当数量的活细胞,但各种马拉色菌对营养条件的依赖性、生长活性的不同以及分离污染的干扰,依靠培养法所得出的鉴定结果不可避免地存在一定的误差,无法取得准确的分析结果。因此基于分子生物学技术、不依赖培养的马拉色菌鉴定方法得以开发应用。

1.临床样本直接提取马拉色菌DNA:Tajima等[11]开发出一种从临床标本中直接提取马拉色菌DNA并进行菌种鉴定方法:可选用棉棒擦拭、手术刀刮取、医用透明敷贴粘贴或适当缓冲液冲洗皮屑(推荐敷贴粘贴,简单、易操作且对皮肤无损伤)。敷贴粘贴取样部位3次以获得足够量的真菌DNA[11],将敷贴置于DNA提取液加热,然后加入Ethachimate催化沉淀进行提取。Zhang等[17]则选取适宜浓度的Triton X-100,先对采集标本的敷贴进行充分洗涤后再行后续的提取和扩增,以保证采集的菌量。DNA测序并分析马拉色菌rRNA基因ITS区和D1/D2 26S rRNA基因是最可靠和准确的鉴定提取是否成功的方法:采用引物ITS1和NL4进行PCR扩增,产物用引物ITS1和ITS4,或者NL1和NL4测序,所得序列上传到 GenBank进行 blast比对(http://www.ncbi.nlm.nih.gov/blast/Blast.cgi)。若D1/D2 26S rRNA基因的相似性＞99%,则可鉴定为同一菌种[7]。

2.巢式PCR:由两套PCR引物(巢式引物)进行两轮PCR反应。首先在常规条件下用第1套跨越目的DNA片段的外引物扩增,第2套内引物结合在第1次PCR产物内部,使得第2次PCR扩增片段短于第1次扩增。由于有2次PCR扩增,巢式PCR法增加了检测的敏感性;同时又有2套PCR引物与检测模板配对,增加了检测的可靠性。Morishita等[18]采用巢式PCR法对花斑糠疹患者所携带的9种亲人性马拉色菌进行了定性分析,从93.9%患者皮损区分别检测出球形马拉色菌及限制马拉色菌,而其他菌种低于35%。Kaga等[19]对56例成人特应性皮炎患者进行鉴定,并与32例健康个体比较,约60%的患者检测出合轴马拉色菌,其余菌种检出率为10%～40%,健康个体与特应性皮炎患者间无明显差异;Zhang等[17]设计了10对巢式引物进行特异扩增,检测中国146例脂溢性皮炎患者,分别从87.0%和81.5%患者皮损区分离出球形马拉色菌及限制性马拉色菌,同时随机抽取60份标本采用传统培养生化方法进行分离鉴定,结果显示,非培养直接DNA提取法在研究菌种构成方面较传统培养生化方法准确且简捷。

3.实时荧光定量PCR:采用特异性TaqMan探针和非特异性SYBR GreenⅠ荧光染料的两种实时荧光定量PCR均已用于定量分析非培养样本的马拉色菌DNA。SYBR GreenⅠ荧光为一种双链DNA结合荧光,可扩增所有双链DNA,检测灵敏度高;不需要设计探针,降低了成本。但其对PCR反应过程中的非特异性扩增或引物二聚体也会产生荧光,从而降低了特异性,必须使用熔解曲线或凝胶分析来检查非特异性产物的构成。TaqMan探针具有基因特异性序列,可与两个PCR引物之间的靶点结合,检测在PCR循环期间聚积的某种特异性PCR产物。与SYBR GreenⅠ荧光染料相比,TaqMan探针对目标序列的特异性更高,其引物设计相对简单,实验重复性好,但探针设计要求较高,成本也更贵。Akaza等[20]以棉棒擦拭40例日本健康个体皮肤取样,设计9对马拉色菌种特异性引物,采用SYBR Green荧光染料+ROX进行实时荧光PCR检测,分析季节、性别、部位与马拉色菌菌种分布的关系。Sugita等[21]采用TaqMan探针实时荧光PCR对特应性皮炎皮损处马拉色菌菌群进行定量定性研究。该方法设计3对特异性引物以及与之对应的TaqMan荧光探针,分别扩增马拉色菌属及2种主要的马拉色菌(球形马拉色菌、限制马拉色菌)靶DNA,其中马拉色菌属特异性引物根据马拉色菌属26S rRNA序列保守区域设计,后两对种特异性引物则来源于rRNA的ITS2区。2012年,Zhang等[22]在此基础上又设计了斯洛菲马拉色菌种特异性引物及对应的TaqMan荧光探针。由于采用绝对定量法,以马拉色菌标准株重组质粒构建标准品制作标准曲线,该方法检测马拉色菌DNA的灵敏度达到10拷贝,将研究引入更深层次,已应用到花斑糠疹、脂溢性皮炎等马拉色菌相关疾病[11，23]及皮肤微生态研究中[22，24]。

四、花斑糠疹马拉色菌临床鉴定研究

花斑糠疹是由马拉色菌所致皮肤角质层浅表感染,在各种马拉色菌相关疾病中,对花斑糠疹的微生态研究开展得较早也最多。既往采用依赖于培养的鉴定方法,可能由于取样方法或取样量不同,不同研究间通过培养得到的马拉色菌生长效率差别很大,在多项研究中皮损部位主要检测结果为球形、合轴和糠秕马拉色菌,限制马拉色菌的检出率很低甚至检测不到。

基于分子生物学技术、不依赖培养的马拉色菌鉴定分析方法的引入,使菌种检测灵敏度显著提高,限制马拉色菌的检出率发生了显著变化:传统培养生化鉴定法仅为0～8.0%,非培养分子生物学鉴定法则为100%。采用非培养法进行巢式PCR,Nakabayashi等[25]发现,花斑糠疹皮损中球形马拉色菌比例为97%,其次是限制马拉色菌(79%)和合轴马拉色菌(68%)。Morishita等[18]从93.9%的花斑糠疹患者皮损区分别检测出球形马拉色菌及限制马拉色菌,而其他菌种的检出率低于35%。Saad等[23]采用TaqMan探针实时荧光PCR方法检测发现,马拉色菌定植量花斑糠疹皮损区是非皮损区的2.7～6.0倍;球形马拉色菌的定植量在花斑糠疹皮损部位最高,限制马拉色菌在非皮损部位最高,而对于健康个体,球形马拉色菌和限制马拉色菌无显著差异,二者总和占马拉色菌总量的95%以上,均为优势菌种。Vuran等[26]从55例土耳其花斑糠疹患者皮损区刮取皮屑后直接提取马拉色菌DNA,采用多重PCR方法检测出其中50例为球形马拉色菌。这些结果使球形马拉色菌是花斑糠疹皮损的优势菌种这个结论得到共识。

五、展望

尽管马拉色菌培养操作复杂,保存不易,球形和限制马拉色菌的流行病学数据资料有限,马拉色菌属种间异型性仍不断被研究,从临床样本中直接检测马拉色菌DNA的方法成为准确鉴定马拉色菌有力工具。菌种分类的日益完善和不依赖培养的分子生物学鉴定方法使马拉色菌与皮肤微生态研究不断发展,相关疾病的研究也更加深入。目前,球形马拉色菌和限制马拉色菌的基因组已测序并被分析[27-28],数字化的PCR技术[29]和高通量测序技术[6]也已广泛应用于临床科研。相信不久以后,通过非培养技术收集更多的mRNA基因数据进行基因组学蛋白组学研究,对致病菌株分离鉴定进行大规模流行病学调查,精确分析鉴定皮肤上共生的每一种马拉色菌及其他微生物将成为现实。

[1]Ashbee HR.Update on the genusMalassezia[J].Med Mycol，2007，45(4):287-303.

[2]Gao Z，Perez-Perez GI，Chen Y，et al.Quantitation of major human cutaneous bacterial and fungal populations[J].J Clin Microbiol，2010，48(10):3575-3581.

[3]Miranda KC，de Araujo CR，Costa CR，et al.Antifungal activities of azole agents against theMalasseziaspecies[J].Int J Antimicrob Agents，2007，29(3):281-284.

[4]Sugita T，Tajima M，Ito T，et al.Antifungal activities of tacrolimus and azole agents against the eleven currently acceptedMalasseziaspecies[J].J Clin Microbiol，2005，43(6):2824-2829.

[5]Cabañes FJ，Vega S，Castellá G.Malassezia cuniculisp.nov.，a novel yeast species isolated from rabbit skin[J].Med Mycol，2011，49(1):40-48.

[6]Findley K，Oh J，Yang J，et al.Topographic diversity of fungal and bacterial communities in human skin[J].Nature，2013，498(7454):367-370.

[7]Sugita T，Tajima M，Tsubuku H，et al.Malassezia//Liu D.Molecular detection of human fungal pathogens[M].FL，USA:CRC Press，2011.

[8]Kaneko T，Makimura K，Sugita T，et al.Tween 40-based precipitate production observed on modified chromogenic agar and development of biological identification kit forMalasseziaspecies[J].Med Mycol，2006，44(3):227-231.

[9]Ramadán S，Sortino M，Bulacio L，et al.Prevalence ofMalasseziaspecies in patients with pityriasis versicolor in Rosario，Argentina[J].Rev Iberoam Micol，2012，29(1):14-19.

[10]Sugita T Kodama M，Saito M，et al.Sequence diversity of the intergenic spacer region of the rRNA gene ofMalassezia globosacolonizing the skin of patients with atopic dermatitis and healthy individuals[J].J Clin Microbiol，2003，41(7):3022-3027.

[11]Tajima M，Sugita T，Nishikawa A，et al.Molecular analysis ofMalasseziamicroflora in seborrheic dermatitis patients:comparison with other diseases and healthy subjects[J].J Invest Dermatol，2008，128(2):345-351.

[12]Sugita T，Tajima M，Amaya M，et al.Genotype analysis ofMalasseziarestrictaas the major cutaneous flora in patients with atopic dermatitis and healthy subjects[J].Microbiol Immunol，2004，48(10):755-759.

[13]Gandra RF，Simão RC，Matsumoto FE，et al.Genotyping by RAPD-PCR analyses ofMalassezia furfurstrains from pityriasis versicolor and seborrhoeic dermatitis patients[J].Mycopathologia，2006，162(4):273-280.

[14]Gupta AK，Boekhout T，Theelen B，et al.Identification and typing ofMalasseziaspecies by amplified fragmentlength polymorphism and sequence analyses of the internal transcribed spacer and large-subunit regions of ribosomal DNA[J].J Clin Microbiol，2004，42(9):4253-4260.

[15]Gaitanis G，Robert V，Velegraki A.Verifiable single nucleotide polymorphisms of the internal transcribed spacer 2 region for the identification of 11Malasseziaspecies[J].J Dermatol Sci，2006，43(3):214-217.

[16]Cafarchia C，Gasser RB，Latrofa MS，et al.Genetic variants ofMalassezia pachydermatisfrom canine skin:body distribution and phospholipase activity[J].FEMS Yeast Res，2008，8(3):451-459.

[17]Zhang H，Ran Y，Xie Z，et al.Identification ofMalasseziaspecies in patients with seborrheic dermatitis in China[J].Mycopathologia，2013，175(1-2):83-89.

[18]Morishita N，Sei Y，Sugita T.Molecular analysis ofMalasseziamicroflora from patients with pityriasis versicolor[J].Mycopathologia，2006，161(2):61-65.

[19]Kaga M，Sugita T，Nishikawa A，et al.Molecular analysis of the cutaneousMalasseziamicrobiota from the skin of patients with atopic dermatitis of different severities[J].Mycoses，2011，54(4):e24-e28.

[20]Akaza N，Akamatsu H，Sasaki Y，et al.CutaneousMalasseziamicrobiota of healthy subjects differ by sex，body part and season[J].J Dermatol，2010，37(9):786-792.

[21]Sugita T，Tajima M，Tsubuku H，et al.Quantitative analysis of cutaneousMalasseziain atopic dermatitis patients using real-time PCR[J].Microbiol Immunol，2006，50(7):549-552.

[22]Zhang E，Tanaka T，Tsuboi R，et al.Characterization ofMalasseziamicrobiota in the human external auditory canal and on the sole of the foot[J].Microbiol Immunol，2012，56(4):238-244.

[23]Saad M，Sugita T，Saeed H，et al.Molecular epidemiology ofMalassezia globosaandMalassezia restrictain Sudanese patients with pityriasis versicolor[J].Mycopathologia，2013，175(1-2):69-74.

[24]Nagata R，Nagano H，Ogishima D，et al.Transmission of the major skin microbiota，Malassezia，from mother to neonate[J].Pediatr Int，2012，54(3):350-355.

[25]Nakabayashi A.Identification of causative species inMalasseziaassociated dermatoses[J].Nihon Ishinkin Gakkai Zasshi，2002，43(2):65-68.

[26]Vuran E，Karaarslan A，Karasartova D，et al.Identification ofMalasseziaspecies from pityriasis versicolor lesions with a new multiplex PCR method[J].Mycopathologia，2014，177(1-2):41-49.

[27]Xu J，Saunders CW，Hu P，et al.Dandruff-associatedMalasseziagenomes reveal convergent and divergent virulence traits shared with plant and human fungal pathogens[J].Proc Natl Acad Sci U S A，2007，104(47):18730-18735.

[28]Dawson TL Jr.Malassezia globosaandrestricta:breakthrough understanding of the etiology and treatment of dandruff and seborrheic dermatitis through whole-genome analysis[J].J Investig Dermatol Symp Proc，2007，12(2):15-19.

[29]Hiruma M，Cho O，Hiruma M，et al.Genotype analyses of human commensal scalp fungi，Malassezia globosa，andMalassezia restrictaon the scalps of patients with dandruff and healthy subjects[J].Mycopathologia，2014，177(5-6):263-269.

2014-03-24)

(本文编辑:颜艳)

10.3760/cma.j.issn.0412-4030.2014.12.025

610041成都,四川大学华西医院皮肤科[尹斌(现在成都市第二人民医院皮肤科,610017)、冉玉平]

冉玉平,Email:ranyuping@gmail.com