超重孕妇低生糖负荷膳食干预对新生儿DNA甲基化影响的探索性研究

程 毅 王丽萍 杨文红 王鹂麟 喻 茜 赵 倩 张 羿 严卫丽

·论著·

超重孕妇低生糖负荷膳食干预对新生儿DNA甲基化影响的探索性研究

程 毅1王丽萍2杨文红3王鹂麟2喻 茜3赵 倩4张 羿1严卫丽4

目的 通过对超重孕妇实施低血糖生成指数(GI)膳食的干预，探讨胎盘组织和脐血中与体重增长有关基因的甲基化的改变。方法 采用随机化单盲对照干预试验设计，研究对象为初次产检孕周≤12周且体重超重的孕妇。以研究对象纳入的顺序号为随机序列号，采用简单随机化的方法随机分为干预组和对照组。干预组在中国孕妇保健规范的基础上结合国家对孕妇的膳食和体力活动规范实施低GI膳食指导干预 ，对照组仅按照国家规范给予指导，不给予低GI膳食的指导。两组分别在孕早期、中期和晚期干预3次。干预组和对照组各纳入25例。孕妇分娩时收集胎盘组织和脐血，提取DNA，采用Illumina甲基化芯片进行两步法全基因组甲基化测定。结果 孕妇孕期相关暴露因素在干预组与对照组差异无统计学意义；胎儿出生体重干预组高于对照组[(3.7±0.5)vs(3.5±0.4) kg]，但差异无统计学意义(P=0.248)。本研究结果结合生物信息数据库分析，筛选出19个基因位点，所属18个基因，其中5个基因位于1号染色体，2个基因位于7号染色体，其余基因分布分散。比较干预组与对照组甲基化的改变，发现脐血中2个差异的甲基化CpG位点，分别位于TEKT5和MIR378C基因上,胎盘组织中1个差异的甲基化CpG位点，所属PGBD5基因。结论 通过对超重孕妇采取低GI膳食干预，胎盘组织和脐血中基因的甲基化可以发生改变，为中国超重、肥胖孕妇疾病的预防提供新的方法，对子代的健康成长有重要的意义。

膳食干预； 血糖生成指数； 超重孕妇； 甲基化

心脑血管疾病是中国的第一位死因，而肥胖是其最危险因素之一。根据2002年全国营养与健康调查数据显示，中国人群超重率为17.6%，肥胖率高达5.6%[1]。中国18～44岁女性(包括大部分育龄妇女)超重/肥胖率达29%[2]。食物血糖生成指数(glycemic index，GI)是以服用50 g葡萄糖的血糖升高数值作为100%，再与食入含50 g碳水化合物的其他食物后血糖升高数值比较的结果。近年来低GI膳食干预除对体重的控制作用外，其降低胰岛素抵抗、改善胰岛素敏感性的健康效应受到广泛关注。目前有关孕妇低GI膳食干预研究报道有限，研究对象分别为健康孕妇[3]、妊娠糖尿病孕妇和超重孕妇，发现低GI膳食有助于降低大胎龄儿比例和胎儿出生体重，低GI膳食干预的妊娠糖尿病孕妇需要胰岛素治疗的比例亦大为降低[4]，其代谢性危险因素水平也降低[5]。孕前或者孕期环境因素通过生殖细胞，或者是胎盘、脐带组织的基因组甲基化，影响子代的表型和表观基因组。如育龄期妇女长期不合理(高GI)膳食、体力活动减少，可能引起其本身的生殖细胞基因组某些基因的甲基化改变，或者作用于胎盘和脐带组织发生甲基化改变，从而影响新生儿基因组甲基化状态，随年龄的变化，产生相应的亚临床或临床表型。那么具有危险因素的孕妇，接受良性膳食干预，可能也会出现某些相关基因甲基化的变化。基于此假设，本文通过对超重孕妇低GI膳食干预，收集孕妇分娩时脐血和胎盘组织，观察膳食干预组与对照组差异的甲基化位点，为超重孕妇膳食干预探索性研究提供一定依据。

1 方法

1.1 研究设计 接受常规体检的孕妇，根据自愿、知情同意的原则，选取符合课题研究条件的孕妇，按照研究对象纳入的顺序号为序列号，采用简单随机化的方法将研究对象随机分为干预组和对照组。分娩时收集脐血和胎盘组织，提取DNA,检测候选基因位点甲基化改变程度，比较两组差异的甲基化位点。

1.2 纳入标准 同时满足以下6项：①初产妇，单胎；②孕妇年龄20～45岁；③孕前BMI≥24 kg·m-2；④初次产检孕周≤12周；⑤初次产检信息数据完整；⑥可定期进行常规产检。

1.3 排除标准 符合以下之一者：①人工受孕者；②在怀孕前或怀孕时患有下列疾病之一者：高血压、糖尿病、冠心病、精神疾病；③特殊饮食习惯者(如素食主义/纯素食主义)。

1.4 分组及干预措施 根据接受干预措施分为干预组和对照组，对照组给予每天膳食总能量规范化摄入和孕期体重合理增长的指导；干预组在对照组的基础上，从低GI食物的选择、膳食搭配和烹调加工方法3个方面给予低GI膳食指导。

1.5 低出生体重儿和巨大儿 按照临床的定义，出生体重<2 500 g为低出生体重儿，～4 000 g为正常出生体重儿，≥ 4 000 g为巨大儿。

1.6 生物学样本的收集和DNA提取 脐血和胎盘组织中DNA均使用QIAamp DNA Mini Kit试剂盒提取。①脐血收集：胎儿娩出并结扎脐带后，取近胎盘端脐血2～4 mL，非抗凝，室温静置，在血样采集3 h内2 000·min-1离心15 min，将血清分装于200 μL EP管后置-20℃保存。②胎盘组织收集：在胎儿娩出后30 min内，以胎盘上脐带为中心，4 cm为半径的圆周上，用一致的采样方法采6个点胎盘组织，装入50 mL锥形管内，干冰处理后置-80℃保存。

1.7 候选基因选取 对独立的10例1周岁婴儿外周血进行全基因组甲基化检测，其中5例母亲孕期体重增长>18 kg，5例母亲孕期体重增长<15 kg，采用Illumina Human Methylation 450K Beadchip芯片进行检测,结合Biological Process，Cellular Component，KEGG Pathways等15种生物信息学数据库分析。

1.8 DNA甲基化检测 ①亚硫酸盐处理基因组，将胞嘧啶C转换成尿嘧啶U，甲基化的C (Methylcytosine)不反应,保持不变；②将处理后的DNA与芯片杂交扫描后，甲基化状态可通过计算荧光信号比例来确定；③根据Illumina甲基化定制芯片每探针甲基化位点原始数据分别进行平均数值标准化(average normalization)预处理；④计算探针水平的甲基化程度(Beta score)[6]，其取值范围[0，1]，表示甲基化探针相对非甲基化探针信号的比率，作为衡量样品各CpG位点甲基化程度的指标。

1.9 统计学分析 使用Access 2003数据库软件进行双人双遍数据录入，逻辑核对无误，进入统计分析。采用Stata 11.0软件(Stata Corp., College Station, TX) 进行数据整理和描述性统计分析。研究对象基本资料分析时计量资料比较经正态性、方差齐性检验后采用独立样本t检验，构成比和率的比较采用χ2检验。分析差异化甲基化时，主要分析探针水平的Beta score，采用两组样本的Wilcox非参数检验，根据Pe ≤0.05筛选差异位点，同时使用M值[6]方法，对筛选的位点进行验证。采用Benjamini & Hochberg方法[7]进行多重检验纠正计算假阳性率 (false discovery rate，FDR)。使用Gene Ontology(GO)[8]对差异的甲基化位点临近基因进行GO功能富积分析。GO功能富积分析是利用超几何分布检验计算代表GO功能集在差异基因转录本列表中是否显著富积的P值， 再对P值经Benjamini & Hochberg多重检验纠正后得到FDR。

2 结果

2.1 母亲和新生儿一般情况 2012年5月至2013年9月符合本研究纳入标准并经排除标准检验的50名孕妇进入分析，干预组和对照组各25例，研究现场为上海市国际和平妇幼保健院(31例)和江苏省昆山市妇幼保健院(19例)。孕妇基本信息：年龄(28.4±2.9)岁，孕前体重(72.2±9.7)kg，孕前BMI(27.6±3.5)kg·m-2，孕周(38.9±1.1)周，孕期体重增长(15.9±7.6)kg；孕妇学历：高中6例，大专18例，大学以上26例；剖腹产74%(37例)，产次为(1.58±0.8)次。孕妇分娩时采集新生儿基本信息：男女婴分别为30和20例，出生体重(3.6±0.4) kg,巨大儿24%(12例)，身长(50.1±3.0)cm； Apgar评分(9.6±0.7)分。

2.2 干预组与对照组母亲孕期相关暴露因素的单因素分析 表1显示，干预组和对照组在母亲孕期暴露因素、新生儿出生基本资料方面差异无统计学意义。

Notes GA: gestational weeks; LMP: last menstrual period; BMI: body mass index of LMP

2.3 甲基化检测位点基因信息 10例1周岁婴儿外周血全基因组甲基化差异分析, 筛选出19个与孕期体重增长有关的甲基化位点，涉及18个基因，甲基化程度升高和降低的位点分别有9个和10个。cg27481428位点位于SHH基因的CpG岛上，其余位点均不在所属基因的CpG岛上；18个基因中有5个基因位于1号染色体，2个基因位于7号染色体，其余基因分布分散(表2)。

Notes GWG1:gestational weight gain>18 kg;GWG2:gestational weight gain<15 kg; Beta_change: average change in beta value between GWG1 and GWG2 group. FDR: false discovery rate

2.4 脐血和胎盘组织DNA差异的甲基化位点分析 干预组和对照组脐血中13个位点甲基化程度降低，其中2个位点差异有统计学意义，分别为cg12682323(MIR378C，P=0.011,FDR=0.811)和cg26477117(TEKT5，P=0.002 9,FDR=0.811)；6个位点甲基化程度升高，差异均无统计学意义。 干预组和对照组胎盘组织中5个位点甲基化程度升高，其中1个位点差异有统计学意义(cg03347632，PGBD5，P=0.041,FDR=0.811)；14个位点甲基化程度降低，差异均无统计学意义。经M值验证,本文所得结果与应用beta score进行检验所得结果不一致。M值分析发现，脐血中有1个位点(cg13949713)在两组间差异有统计学意义(P=0.036)。

Go Term分析显示，TEKT5基因参与细胞组成，主要与细胞纤毛形成和细胞质的形成有关。MIR378C基因是一种具有调控功能的非编码RNA， 参与MicroRNAs的转录和稳定性，调控转录后基因的表达。而PGBD5是一种由455个氨基酸组成的Ⅰ型跨膜蛋白，是PGBD家族成员之一，主要参与分子的跨膜运输。

Notes Intervention_mean: average beta value of treat group;Control_mean: average beta value of control group;Beta_change:average change in beta value minus intervention and control groups;P1:the test ofPvalue of two groups usingMvalue[6]

3 讨论

国外大量研究表明母亲宫内环境因素将导致表观遗传学调控机制改变，从而影响胎儿的出生体重，还有可能对某些胎源性疾病发展产生一定的影响[9,10]。研究证实，母亲孕期营养能够改变后代DNA的甲基化，从而对胎儿的结局有重要的影响[11]。胎儿早期发育营养受限可能增大儿童期或成人期心血管疾病患病的风险，营养过剩是儿童期或成人期发生肥胖的危险因素。母亲孕前超重、糖尿病与后代的肥胖有一定关联，这可能与遗传和子宫内环境有关[12, 13]。母亲孕期体重增长过高能够增加后代2～14岁儿童超重的风险[14～16]。基于上述研究结果本研究提出了假设，孕期不良营养因素可导致胎盘和脐血的某些基因的甲基化改变，与此相比较而言，给予良性营养因素的刺激(如低GI膳食)，是否可以观察到相同基因的甲基化改变呢？其方向如何？已有临床研究证据表明，超重孕妇的膳食管理，包括低GI 膳食干预可改善新生儿的结局和孕妇妊娠结局[17,18]。低GI膳食干预，是在每天膳食总能量的规范化摄入、指导孕期体重合理增长的基础上，从低GI食物的选择、膳食搭配和烹调加工方法3个方面给予指导，对膳食中碳水化合物的种类进行科学的调整，如果研究证实了本文的假设，低GI膳食指导可作为预防中国特殊人群(孕妇)疾病“温和的干预”提供理论依据。

本研究脐血的差异基因为TEKT5和MIR378C,差异基因在干预组中甲基化程度比对照组略低(Beta score差值分别为-0.022和-0.042)，而在母亲孕期体重增长过多和对照组之间两位点的差别分别为-0.326和-0.243,组间的甲基化程度差异明显缩小。似乎支持本研究假设，即良性营养因素与不良营养因素的同一位点甲基化的作用是相反的。胎盘组织中差异基因为PGBD5，干预组中甲基化程度比对照组略高(Beta score差值为0.032)，而在母亲孕期体重增长过多和对照组婴儿之间该位点的甲基化差异为0.201，方向相同，亦支持本研究的假设。

本研究发现的几个差异甲基化的基因与孕期的营养因素的关系目前尚不清楚。人类的TEKT5基因由7个外显子组成，位于16号染色体长臂端13区13带。TEKT5 mRNA的表达在正常组织被限定在特殊的器官，但这种基因在多种癌症组织(肝癌、肺癌、结肠癌)被检测到。TEKT5基因还被用于癌症患者诊断和免疫治疗的靶点[22]。MIR378C是一种具有调控功能的非编码RNA,能够转染细胞，使肿瘤细胞具有癌细胞的特性，还具有增强细胞生存、肿瘤生长和血管形成作用[23]。一项关于胃癌相关微小RNA表达的表观遗传学调控机制的研究，证实了基因启动子区高甲基化是导致胃癌细胞中miR-195和miR-378低表达的主要原因。PGBD5是piggyBac 转座子蛋白家族基因，PGBD5是一种贯穿生物膜两端的蛋白，作为通道允许或拒绝特定物质跨过生物膜运输，进入细胞。PGBD5不同于其他人类piggyBac 转座子获得的基因，该基因有9个内含子，均匀分散在基因上[24]。TEKT5基因参与纤毛和鞭毛的形成，可能会影响细胞运动功能。MIR378C基因甲基化改变，可能促进肿瘤细胞的生长和血管的形成，而PGBD5基因甲基化改变可能会改变跨膜蛋白的转运功能。而这些基因甲基化改变与本研究的干预因素和临床结局的关系还无法阐明。本研究通过“温和的干预”可以导致某些和重要生物学功能相关的基因甲基化的改变，这为深入研究提供了一定的基础，但为了阐明甲基化的改变与临床结局之间的关系，也还需更大样本量进一步证实。

本研究未发现干预组与对照组的新生儿出生体重有明显差异，可能与当前纳入的样本量较小有关。而新生儿出生体重的基线资料在两组中差异无统计学意义，干预组母亲的孕前BMI比对照组略高。此外，虽然对照组孕妇未接受低GI膳食指导，但随着大众传媒的发展，孕妇可通过网络或电视，了解有关饮食知识，可导致两组间孕妇的膳食GI差异缩小。随着研究的进行，样本量进一步扩大，待完成随机化设计的所有样本后， 这些基线因素的差异会达到平衡。

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(本文编辑：张崇凡)

Exploratory study on the diet intervention during pregnancy to overweight pregnant women--effect of low glycemic load diet on DNA methylation of placenta tissue and cord blood of neonates

CHENG Yi1, WANG Li-ping2,YANG Wen-hong3,WANG Li-ling2,YU Qian3,ZHAO Qian4,ZHANG Yi1,YAN Wei-li4

( 1 Department of Epidemiology and Statistics, Xinjiang Medical University of Public Health, Urumqi 830001;2 The International Peace Maternity & Child Health Hospital of Shanghai Jiaotong University, Shanghai 200030;3 Kunshan Maternal and Child Health Care Hospital, Jiangsu Province, Kunshan 215300;4 Department of Clinical Epidemiology, Children's Hospital of Fudan University, Shanghai 201102, China)

YAN Wei-li，E-mail:yanwl@fudan.edu.cn

ObjectiveTo evaluate whether the low glycemic load diet intervention during pregnancy to overweight pregnant women have any impact on DNA methylation in placenta tissue and cord blood of their neonates.MethodsRandomized, single blinded, controlled intervention trial was selected. Overweight pregnant women (BMI≥24 kg·m-2) were recruited at first prenatal visit within 12 gestational weeks. Subjects were randomized by simple randomization and allocated into two groups, intervention group and control group. The intervention group was provided 3 times diet consultation about low glycemic load diet combined with the national diet and physical activity recommendations for pregnant women. The control group was given only national diet and physical acitivity recommendations. This paper included the first recruited 50 overweight pregnant women. Placenta tissue and cord blood sample were collected at delivery and properly treated according to standard protocol. The methylation of the placenta tissue DNA and umbilical cord blood DNA was detected by two-step genome wide methylation-based association analysis strategy. Illumina 450K whole genome Beadchip was applied for the first stage differential methylation analysis, and Illumina custom designed Goldengate methylation chip was used for the second stage methylation association analysis.ResultsBirth weight of intervention group was heavier than control group, (3.7±0.5)vs(3.5±0.4) kg, but the difference was not significant(P=0.248). The meathylation of 2 of 19 CpG sites was significantly different in umbilical cord blood between two groups, locating inTEKT5 andMIR378 gene, respectively. However, there was 1 of 19 CpG sites significantly different in placenta tissue which located inPGBD5.ConclusionThese novel data provided evidence that neonatal DNA methylation varied with low glycemic index diet intervention during pregnancy to overweight pregnant women. The long-term stablity and potential contribution of these changes to clinical postnatal outcomes need further investigation.

Diet intervention; Glycemic index; Overweight pregnant women; Methylation

国家自然科学基金：81273168

1 新疆医科大学公共卫生学院流行病学与卫生统计学教研室 新疆，830001；2 上海交通大学医学院附属国际和平妇幼保健院 上海，200030；3 江苏省昆山市妇幼保健所 昆山，215300；4 复旦大学附属儿科医院临床流行病学研究室 上海，201102

严卫丽，E-mail: yanwl@fudan.edu.cn

10.3969/j.issn.1673-5501.2014.01.003

2014-01-03

2014-01-30)