miR-30b对结直肠癌细胞转移潜能的影响*

吴 萍 冶亚平 丁彦青 廖雯婷

·基础研究·

miR-30b对结直肠癌细胞转移潜能的影响*

吴 萍 冶亚平 丁彦青 廖雯婷

目的：明确miR-30b对结直肠癌细胞侵袭和迁移潜能的影响。方法：RT-qPCR检测20对配对结直肠癌组织标本中miR-30b的表达；Transwell和划痕实验检测过表达和抑制miR-30b后结直肠癌细胞侵袭和迁移潜能的改变；应用生物信息学方法预测miR-30b的作用靶点；Western Blot及双荧光素酶报告基因实验验证过表达和抑制miR-30b后靶点Snail和EMT（epithelial mesenchymal transition）标志物的表达情况。结果：癌组织中miR-30b表达水平明显低于正常肠黏膜组织；Transwell及划痕实验结果显示过表达miR-30b后结直肠癌细胞的侵袭迁移能力降低，抑制miR-30b后侵袭迁移能力增强；生物信息学预测结果显示miR-30b能够作用于Snail 3'-UTR，双荧光素酶检测结果进一步证实miR-30b能够作用于Snail 3'-UTR；Western Blot结果显示过表达miR-30b后Snail的表达下降，EMT标志物Vimentin表达下降和E-cadherin表达升高，而抑制miR-30b后结果相反。结论：miR-30b在结直肠癌中表达水平下降，并通过靶向Snail调节结直肠癌细胞的侵袭和迁移。

结直肠癌 miR-30b 侵袭 迁移 Snail

结直肠癌（colorectal carcinoma，CRC）是我国发病率第三位的恶性肿瘤，发病率呈逐年上升的趋势［1］。转移是导致结直肠癌患者死亡的主要原因，早期的结直肠癌5年生存率可以达90%，但发生转移的结直肠癌5年生存率仅为10%～15%。肿瘤转移是一个多步骤、多阶段的复杂过程［2］。微小RNA（microRNA，miRNA）是近年来发现的一类非编码单链小分子RNA，长度约19～25个核苷酸，通过与靶基因mRNA的3'非编码区（3'-untranslated region，3'-UTR）结合负性调节靶基因的表达［3］。大量研究显示miRNA与多种恶性肿瘤的发生和转移密切相关［4-6］。前期本课题组研究发现miR-30b能抑制结直肠癌的发生并促进结直肠癌细胞发生凋亡［7］。但miR-30b在结直肠癌侵袭转移中的作用及分子机制并不清楚。本研究旨在探讨miR-30b对结直肠癌细胞侵袭迁移潜能的影响，并初步探讨其分子机制。

1 材料与方法

1.1 材料

1.1.1 组织标本 20对配对结直肠癌组织标本取自南方医科大学附属南方医院2008年12月至2009年10月手术患者，均经病理证实为腺癌，标本置于液氮保存，用以抽提总RNA。

1.1.2 细胞株 人结直肠癌细胞株HCT116和SW480为南方医科大学病理学实验室自存。

1.1.3 实验试剂 胎牛血清、RPMI-1640（购自美国Gibco公司），反转录试剂盒、Taq HS酶、Trizol（购自日本Taraka公司），LipofectamineTM2000试剂盒（购自美国Invitrogen公司），PVDF膜（购自美国Millipore公司 ），miR-30b mimics、miR-30b inhibitor和All-in-OneTMmiRNA qRT-PCR检测试剂盒（购自美国Genecopoeia公司），Dual-Luciferase®Reporter Assay System试剂盒（购自美国Promega公司），Snail兔抗人单克隆抗体（购自美国Cell signaling公司），Transwell小室（购自美国BD公司）。

1.2 方法

1.2.1 细胞培养 人结直肠癌细胞株HCT116和SW480在含10%的胎牛血清的RPMI-1640培养基中，37℃CO2体积分数为5%条件下培养，1～2 d换液1次。取对数生长期细胞接种于6孔板，设置negative control转染组、miRNA-30b mimics和miR-30 inhibitor转染组。基因转染步骤参照LipofectamineTM2000试剂盒说明书进行，转染后24 h检测RNA、48 h检测蛋白。

1.2.2 组织总RNA提取 取新鲜结肠癌及癌旁正常组织，在液氮中研磨后加Trizol试剂裂解，按常规方法提取组织RNA，并测定RNA浓度。

1.2.3 实时定量PCR检测组织及细胞中miR-30b的表达 组织RNA及转染后24 h收集的细胞RNA，按miRNA逆转录试剂盒说明书逆转录成cDNA后，采用特异的引物扩增，进行实时定量PCR检测，反应条件50℃2 min，95℃10 min预变性，95℃15 s，60℃1 min，72℃34 s，40个循环，反应结束后得Ct值。根据公式2-［（CtofmiR-30b）-（CtofU6）］计算目的基因相对含量，实验重复3次。

1.2.4 Transwell迁移实验 细胞转染后24 h消化和计数，加入放置了Transwell小室的24孔板中，上层小室加入含20%胎牛血清的培养基，下层小室加入含10%胎牛血清的培养基，孵育48 h后，取出、固定、染色，显微镜下随机选取视野拍照计数，实验组和对照组各设置3个重复。

1.2.5 划痕实验 细胞转染前24 h消化和计数，在6孔板中加入5×105个细胞，待细胞达到70%～80%汇合时进行转染，按LipofectamineTM2000说明书操作。转染24 h后，用枪头垂直于6孔板划1条横线划痕，用PBS洗细胞3次，去除划下的细胞，加入完全培养基，放入37℃、5%CO2培养箱中培养，按0、18、36 h取样，拍照。

1.2.6 Western Blot法检测过表达或抑制miR-30b后Snail的表达 蛋白用10%SDS-PAGE凝胶进行电泳分离，湿转法转印至PVDF膜上，转膜结束后兔抗人的Snail单克隆抗体孵育过夜，次日加入辣根过样化物酶标记的二抗，于室温孵育45 min后，洗脱抗体，常规显色发光。

1.2.7 载体构建PGL3-Snail 3'-UTR-WT 以人结直肠癌细胞基因组DNA为模板，扩增Snail 3'-UTR，将该片段克隆至PGL3-Basic vector，经质粒转化、小量提取、质粒PCR鉴定测序得到种族质粒PGL3-Snail 3'-UTR-WT。

1.2.8 重组质粒PGL3-Snail 3'-UTR的定点突变 设计突变序列引物，以人结直肠癌细胞基因组DNA为模板，扩增突变序列，将突变序列片段克隆至PGL3-Basic vector，经双酶切、连接、转化、摇菌、质粒提取、测序鉴定得到突变质粒PGL3-Snail 3'-UTR-MUT。

1.2.9 双荧光素酶报告基因实验 HCT116转染前24h消化和计数细胞，在24孔板中接种5×104个细胞，待细胞达到60%汇合进行转染。按LipofectamineTM2000说明书操作。转染分3组：mimics+PGL3-vector、mimics+ 3'-UTR-WT、mimics+3'-UTR-MUT；设3个复孔。转染后按照Dual-Luciferase®Reporter Assay System说明书进行操作。

1.3 统计学分析

采用SPSS 13.0统计软件进行统计学处理，两组计量资料采用非参数Wilcoxon符号秩检验，均数比较采用独立样本t检验，各组间比较采用方差分析，P＜0.05为差异具有统计学意义。

2 结果

2.1 miR-30b在结直肠癌组织中表达水平

实时定量PCR检测结果显示，20例癌组织中miR-30b相对表达的中位数为4.1133，四分位间距为3.022 7至5.675 4；而对应癌旁正常组织中miR-30b的相对表达中位数为9.909 7，四分位间距为5.990 8至16.007 6。采用配对样本的Wilcoxon符号秩检验，癌组织中miR-30b表达量明显降低，两者差异具有统计学意义（P＜0.001，图1）。

2.2 结直肠癌细胞中miR-30b过表达和抑制效果

实时定量PCR结果显示，与对照组相比，HCT116瞬时转染miR-30b mimics后，miR-30b的表达升高（图2），差异具有统计学意义（t=-9.581，P=0.001）；SW480转染miR-30b inhibitor后，miR-30b的表达明显下降（图2），差异具有统计学意义（t=8.685，P=0.001）。

2.3 过表达和抑制miR-30b后结直肠癌细胞侵袭迁移潜能的改变

Transwell迁移实验结果显示，与对照组相比，结直肠癌细胞HCT116过表达miR-30b后迁移的细胞明显减少，差异具有统计学意义（t=20.552，P＜0.001）。而在SW480中抑制miR-30b后迁移的细胞明显增多，差异具有统计学意义（t=-14.08，P＜0.001，图3）。此外，划痕实验结果显示，HCT116过表达miR-30b后在0 h至36 h间细胞迁移平均距离为0.988 mm，而对照组细胞迁移平均距离为0.463 mm，差异具有统计学意义（t=21.909，P＜0.001）；SW480抑制miR-30b后在0 h至36 h间细胞迁移平均距离为1.046 mm，而对照组细胞迁移平均距离为0.558 mm，差异具有统计学意义（t=-6.997，P=0.002），说明过表达miR-30b后细胞的迁移能力明显减弱，而抑制miR-30b后细胞的迁移能力明显增强。

2.4 miR-30b作用靶点的预测及验证

microRNA靶基因预测软件TargetScan发现miR-30b能够作用于Snail 3'-UTR（图4A）；双荧光素酶报告基因实验显示共转染重组质粒Snail-3'-UTR-MUT、Snail-3'-UTR-WT以及miRNAs后，与对照组相比，Snail-3'-UTR-WT和miRNAs共转染后Snail的荧光素酶活性降低（图4C），差异具有统计学意义（F=31.953，P=0.001）；Western Blot检测发现过表达miR-30b后，Snail的表达明显下降，抑制miR-30b后Snail的表达升高（图4B）。

2.5 过表达和抑制miR-30b后结直肠癌细胞中EMT标志物的改变

进一步采用Western Blot结果显示，HCT116过表达miR-30b后，EMT标志物E-cadherin表示上升，而Vimentin表达下降；相反，SW480中抑制miR-30b后，E-cadherin表示下降，而Vimentin表达上升（图4B）。

3 讨论

结直肠癌是人类常见的恶性肿瘤之一，近年来结直肠癌的发病率与死亡率呈逐年上升的趋势［3，7］。研究发现大多数结直肠癌患者最终死于肿瘤远处转移相关的并发症。结直肠癌的转移是一个复杂的、多步骤和多因素参与的过程，包括有肿瘤微环境的改变、上皮细胞间质转化（EMT）、细胞迁移和运动能力的改变以及血管生成等因素。近年的研究发现miRNA在肿瘤的发病机制中发挥十分重要的作用。研究显示miRNA与乳腺癌、肺癌、宫颈癌、胃癌、膀胱癌、结直肠癌等肿瘤的发生发展密切相关，并参与多种肿瘤转移的调节。研究发现在结直肠癌中miR21、miR22、miR143、miR145、miR195、miR196、miR107、miR192等miRNAs与结直肠癌转移相关［8-14］。

研究显示Snail参与细胞间的黏附作用，Snail表达升高会导致上皮细胞-间充质细胞转化即EMT的发生，从而引起肿瘤的发生发展、迁移与转移［15］。大量的研究表明，肿瘤的迁移、转移与Snail的过度表达密切相关，如非小细胞肺癌［16］、胃癌［17］及膀胱癌［18］等。研究表明在用TGF-β诱导小鼠正常肝细胞发生EMT时，miR-30b可负性调控Snail，抑制EMT的发生［19］。

本课题组在前期研究中发现，miR-30b能抑制结直肠癌细胞的周期进程，并能抑制凋亡［7］。但miR-30b在结直肠癌侵袭中的作用及分子机制尚未研究清楚。本研究的实验结果提示，miR-30b在结直肠癌中表达下调，在结直肠癌细胞中抑制miR-30b的表达能增强结直肠癌细胞的侵袭迁移能力、上调Snail的表达，并抑制Snail下游基因E-cadherin表达、促进Vimentin的表达，进而诱导EMT，从而增强结直肠癌的侵袭迁移能力。同时，本实验证实了在结直肠癌细胞中，miR-30b能靶向作用于Snail 3'-UTR，下调Snail的表达。

综上所述，本实验结果表明miR-30b在结直肠癌组织中低表达，miR-30b能调控Snail影响其下游基因的表达从而促进结直肠癌细胞转移，更为miRNA作为新的结直肠癌转移分子标志物提供科学依据。

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（2014-04-23收稿）

（2014-05-10修回）

（本文编辑：郑莉）

The function of miR-30b in colorectal cancer metastasis

Ping WU,Yaping YE,Yanqing DING,Wenting LIAO
Correspondence to:Wenting LIAO;E-mail:liaowt2002@gmail.com

Department of Pathology,School of Basic Medical Sciences,Southern Medical University,Guangzhou 510515,China

This work was supported by the National Natural Science Foundation of China(No.81172055,81071735,U1201226)

Objective:To determine the function of miR-30b in the metastasis of colorectal cancer cells.Methods:RT-qPCR was performed to test miR-30b expression in 20 fresh primary colorectal cancer tissues and their corresponding adjacent tissues.Transwell and wound healing assays were performed to test the invasion and migration of colorectal cancer cells after miR-30b overexpression or inhibition.Bioinformatics assay was performed to predict miR-30b targets.Western Blot and Dual Luciferase reporter assay were performed to test the expressions of Snail and downstream target genes in colorectal cancer cells.Results:The results reveal that miR-30b expression decreased in cancer tissues compared with normal tissues.Transwell and wound healing assays reveal that miR-30b overexpression inhibited cell invasion and migration,whereas miR-30b inhibition promoted the invasion and migration of colorectal cancer cells.Bioinformatics analyses reveal that miR-30b targets the 3'-UTR of Snail.Dual Luciferase reporter assay confirms that miR-30b affects the 3'-UTR of Snail.Western Blot analyses show that Snail and Vimentin expressions were significantly downregulated,whereas E-cadherin expression obviously increased after miR-30b overexpression.However,Snail and Vimentin expressions increased,but E-cadherin expression decreased after miR-30b inhibition.Conclusion:The miR-30b gene is downregulated in colorectal cancer tissues.The miR-30b protein may be important in the regulation of cell invasion and migration by targeting Snail in colorectal cancer cells.

colorectal cancer,miR-30b,invasion,migration,Snail

10.3969/j.issn.1000-8179.20140670

吴萍 在读硕士研究生。研究方向为肿瘤病理学。

南方医科大学基础医学院病理学系（广州市510515）

*本文课题受国家自然科学基金项目（编号：81172055，81071735，U1201226）资助

廖雯婷 liaowt2002@gmail.com

日期：2014-05-19 网络出版地址：http：//www.cnki.net/kcms/detail/12.1099.R.20140519.0952.002.html

E-mail：pingping198765@163.com