猪苓菌丝体的化学成分研究△

陈晓梅，周微微，王春兰，郭顺星

(中国医学科学院 北京协和医科大学 药用植物研究所，北京 100193)

猪苓菌丝体的化学成分研究△

陈晓梅，周微微，王春兰，郭顺星*

(中国医学科学院 北京协和医科大学 药用植物研究所，北京 100193)

目的研究液体发酵猪苓菌丝体的化学成分。方法3000 L发酵罐发酵生产猪苓菌丝体，95%乙醇提取，硅胶、凝胶等柱色谱方法纯化化合物，红外、质谱、核磁共振等谱学技术鉴定化合物的结构。结果从猪苓菌丝体中分离鉴定了12个化合物，分别是：麦角甾醇(1)、麦角甾-7，22-二烯-3，5，6-三醇(2)、麦角甾-7，22-二烯-3-酮(3)、猪苓酮A(4)、猪苓酮B(5)、α-羟基二十四烷酸乙酯(6)、N-(2′-羟基二十四烷酰)-1，3，4-三羟基-2-十八鞘氨(7)、腺苷(8)、烟酸(9)、琥珀酸(10)、尿嘧啶(11)和尿苷(12)。结论化合物1～12均为首次从猪苓菌丝体中分离获得。

猪苓；菌丝体；化学成分；甾体化合物

中药猪苓来源于担子菌纲多孔菌科多孔菌属真菌猪苓Polyporusumbellatus(Pers)Fr.的干燥菌核，是一种常用的菌类药材，在我国已经有2 000多年的药用历史。现代研究表明，猪苓菌核含有麦角甾醇、多糖及甾酮类化合物；其中的麦角甾-4，6，8(14)，22-四烯-3-酮是猪苓菌核利尿作用的主要活性成分[1-2]；包括猪苓酮A和B在内的多种甾酮类化合物都具有细胞毒活性[3-5]；猪苓多糖具有抗肿瘤和提高机体免疫力的作用，其免疫刺激作用与TLR4信号通路的激活有关[6-8]。

随着中药猪苓抗肿瘤作用的发现，药材用量快速增长，加之野生猪苓的繁殖能力很低，导致其自然资源日益枯竭。猪苓的生长发育需要经历担孢子、菌丝体、菌核和子实体4个阶段，其菌核的生长依靠蜜环菌提供营养，两者之间形成共生关系[9]。在此基础上发展建立的猪苓半野生栽培法虽然获得了一定的成功，但该方法需要大量菌核作为种苓，种苓栽种后3～4年方能收获，且产量不够稳定[10]。菌丝体是猪苓生长发育的一个必经阶段。有关液体发酵生产猪苓菌丝体及猪苓菌丝体多糖的研究较多[11-13]，菌丝体多糖能显著提高小鼠的免疫功能[14]；也有一些以甾体类化合物为目的产物发酵生产猪苓菌丝体的研究[15-16]。但是，目前还没有关于猪苓菌丝体小分子化学成分的研究报道。

为了阐明猪苓菌丝体和菌核的化学相关性，科学合理地开发利用猪苓菌丝体，笔者研究了液体发酵猪苓菌丝体的小分子化学成分，共分离纯化得到12个化合物，分别鉴定为麦角甾醇(1)、麦角甾-7，22-二烯-3，5，6-三醇(2)、麦角甾-7，22-二烯-3-酮(3)、猪苓酮A(4)、猪苓酮B(5)、α-羟基二十四烷酸乙酯(6)、N-(2′-羟基二十四烷酰)-1，3，4-三羟基-2-十八鞘氨(7)、腺苷(8)、烟酸(9)、琥珀酸(10)、尿嘧啶(11)和尿苷(12)。以上成分均为首次从猪苓菌丝体中分离得到。

1 仪器与材料

X-4显微熔点测定仪(温度未校正)；Hitachi UV-2201 紫外/可见分光光度计；Impact 410 FT-IR型红外光谱仪，KBr压片；Varian INOVA 600型核磁共振仪，TMS为内标；Bruker Daltonics APEX II FT-ICR-MS质谱仪；柱色谱硅胶(青岛海洋化工厂)；Sephadex LH-20(Pharmacia公司)；GF254和HF254高效薄层板(青岛海洋化工厂)；其他试剂均为分析纯(北京化工厂)。

猪苓菌种为中国医学科学院药用植物研究所生物技术中心保藏菌种，菌株编号GZ-06。生产流程：-80 ℃菌种→PDA斜面菌种→500 mL三角瓶液体种子→500 L种子罐发酵→3 000 L发酵罐发酵→板框过滤→真空干燥→粉碎→菌丝体粗粉。

三角瓶(500 mL)液体发酵条件：装量200 mL，培养基组成：玉米面30 g·L-1、酵母膏30 g·L-1、磷酸二氢钾1.0 g·L-1、硫酸镁1.0 g·L-1、碳酸钙 0.5 g·L-1、维生素B10.5 g·L-1，pH 6.0，温度(25±1)℃，摇床转速120 r·min-1，发酵15 d。一级种子罐(500 L)发酵条件：投料体积300 L，投料糊精6 kg，蛋白胨3.6 kg，酵母提取物1.2 kg，pH 6.2，温度(25±1) ℃，通气1∶0.5，不开搅拌，190 h转接。发酵罐(3 000 L)发酵条件：投料体积2 000 L，投料玉米淀粉50 kg，豆饼粉30 kg，玉米浆50 kg，耐高温α-淀粉酶30 g，pH 6.2，温度(25±1)℃，通气1∶0.5，间歇搅拌(每8 h搅拌10 min)，搅拌速度120 r·min-1，115 h终止。

2 提取与分离

猪苓菌丝体粗粉(约2 kg)，95%乙醇总用量为80 L，分3次回流提取，每次提取2 h，合并提取液，减压回收溶剂，获得总提取物浸膏320 g。将总提取物混悬于水中，依次用石油醚、二氯甲烷、乙酸乙酯、正丁醇萃取，获得各部位浸膏187 g、15.2 g、14.6 g、32.7 g。取石油醚部位170 g进行硅胶柱色谱，石油醚-乙酸乙酯梯度洗脱，共得到22个组分(Fr.1～Fr.22)。组分Fr.8重结晶得到化合物1(10 g)；组分Fr.11～Fr.13合并后经硅胶柱色谱[三氯甲烷-甲醇(95∶5)洗脱]，小流分fr.11得到化合物2(5 mg)，小流分fr.14得到化合物6(17 mg)；组分Fr.20～Fr.22合并后经硅胶柱色谱[三氯甲烷-甲醇(95∶5)洗脱]，得到化合物3(5 mg)。取二氯甲烷部位12 g进行硅胶柱色谱，三氯甲烷-甲醇梯度洗脱，共得到20个组分(Fr.1～Fr.20)。组分Fr.16～Fr.17合并后经Sephadex LH-20柱色谱(甲醇洗脱)，得到化合物4(4 mg)和5(3 mg)；组分Fr.20经硅胶柱色谱[三氯甲烷-甲醇(95∶5)洗脱]，得到化合物7(110 mg)。取乙酸乙酯部分12 g进行硅胶柱色谱，三氯甲烷-甲醇梯度洗脱，共得到10个组分(Fr.1～Fr.10)。组分Fr.1经硅胶柱色谱[三氯甲烷-甲醇(9∶1)洗脱]，小流分fr.7～fr.11合并，经反复重结晶，得到化合物8(100 mg)；组分Fr.3经硅胶柱色谱[三氯甲烷-甲醇(93∶7)洗脱]，小流分fr.7经重结晶，得到化合物9(20 mg)；组分Fr.7～Fr.10合并后经Sephadex LH-20柱层析(甲醇洗脱)，小流分fr.14～fr.16合并，得到化合物10(30 mg)。取正丁醇部分30 g进行硅胶柱色谱，三氯甲烷-甲醇-水梯度洗脱，共得到10个组分(Fr.1～Fr.10)。组分Fr.1～Fr.3合并后反复重结晶，得到化合物11(5 g)；组分Fr.10经重结晶，得到化合物12(200 mg)。

3 结构鉴定

化合物1：无色针状结晶(三氯甲烷)。mp 151～152 ℃。ESI-MSm/z：396[M]+，与麦角甾醇对照品在多种展开系统中进行TLC比较，Rf值均一致，且与对照品混合熔点不下降，故鉴定化合物1为麦角甾醇(ergosterol)，为首次从猪苓菌丝体中分离获得。

化合物2：白色粉末状固体(三氯甲烷)。EI-MSm/z：430[M]+。1H-NMR(py-d5，600 MHz)δ：5.26(1H，dd，J=15.6，7.8 Hz，H-23)，5.21(1H，dd，J=15.6，7.8 Hz，H-22)，5.16(1H，m，H-7)，4.82(1H，m，H-3)，4.31(1H，br.s，H-6)，1.06(3H，d，J=6.6 Hz，Me-21)，0.94(3H，d，J=6.6 Hz，Me-28)，0.86(3H，d，J=6.6 Hz，Me-26)，0.81(3H，d，J=6.6 Hz，Me-27)，0.66(3H，s，Me-18)；13C-NMR(py-d5，150 MHz)δ：141.5(C-8)，136.2(C-22)，132.1(C-23)，120.5(C-7)，76.1(C-5)，74.3(C-6)，67.6(C-3)，56.1(C-17)，55.2(C-14)，43.8(C-9)，43.8(C-13)，43.1(C-24)，42.0(C-4)，40.9(C-20)，39.9(C-12)，38.1(C-10)，33.8(C-1)，33.3(C-25)，32.7(C-2)，28.5(C-16)，23.5(C-11)，22.4(C-15)，21.4(C-21)，20.1(C-26)，19.8(C-27)，18.8(C-19)，17.8(C-28)，12.5(C-18)。以上数据与文献报道的麦角甾-7，22-二烯-3，5，6-三醇(ergosta-7，22-dien-3，5，6-triol)基本一致[17]，为首次从猪苓菌丝体中分离获得。

化合物3：白色片状结晶(三氯甲烷)。mp 186～187 ℃。EI-MSm/z：396[M]+。1H-NMR(CDCl3，600 MHz)δ：5.19(3H，m，H-7，22，23)，1.03(3H，s，Me-21)，1.02(3H，s，Me-19)，0.92(3H，d，J=6.6 Hz，Me-28)，0.84(3H，d，J=6.6 Hz，Me-26)，0.82(3H，d，J=6.6 Hz，Me-27)，0.58(3H，s，Me-18)；13C-NMR(CDCl3，150 MHz)δ：211.9(C-3)，139.5(C-8)，135.6(C-22)，132.0(C-23)，117.0(C-7)，55.9(C-17)，55.0(C-14)，48.9(C-9)，44.2(C-4)，43.3(C-13)，42.9(C-5)，42.8(C-24)，40.5(C-20)，39.3(C-12)，38.8(C-1)，38.1(C-2)，34.4(C-10)，33.1(C-25)，30.1(C-6)，28.1(C-16)，22.9(C-15)，21.7(C-11)，21.1(C-21)，19.9(C-26)，19.6(C-27)，17.6(C-28)，12.4(C-19)，12.1(C-18)。以上数据与文献报道的麦角甾-7，22-二烯-3-酮(ergosta-7，22-dien-3-one)基本一致[18]，为首次从猪苓菌丝体中分离获得。

化合物4：无色针状结晶(甲醇)。mp 261～262 ℃。EI-MSm/z：442[M-2H2O]+，363[M-C6H11]+，345[M-C6H11-H2O]+(基峰)，327，309，269，71。1H-NMR(py-d5，600 MHz)δ：6.27(1H，d，J=2.4 Hz，H-7)，4.23(1H，br.s，H-3)，4.17(1H，br.d，H-2)，3.92(1H，dd，J=9.6，4.8 Hz，H-22)，3.60(1H，br.t，J=8.4Hz，H-9)，2.93(1H，t，J=9.0Hz，H-17)，1.57(3H，s，Me-21)，1.43(1H，septed，J=6.6Hz，H-25)，1.23(3H，s，Me-18)，1.08(3H，s，Me-19)，0.87(3H，d，J=7.2Hz，Me-26)，0.85(3H，d，J=6.6Hz，Me-27)，0.74(3H，d，J=6.6Hz，Me-28)；13C-NMR(py-d5，150 MHz)δ：15.7(C-27)，16.0(C-26)，17.9(C-18)，21.1(C-11)，21.4(C-28)，21.4(C-21)，21.5(C-12)，24.5(C-19)，29.5(C-25)，31.7(C-16)，32.1(C-15)，32.5(C-4)，34.5(C-9)，36.1(C-24)，37.3(C-23)，38.0(C-1)，38.7(C-10)，48.1(C-13)，49.9(C-17)，51.4(C-5)，68.1(C-3)，68.1(C-2)，74.5(C-22)，76.8(C-20)，84.1(C-14)，121.1(C-7)，166.2(C-8)，203.5(C-6)。以上数据与文献报道的猪苓酮A(polyporusterone A)基本一致[3]，为首次从猪苓菌丝体中分离获得。

化合物5：无色针状结晶(甲醇)。mp 250～251 ℃。EI-MSm/z：440[M-2H2O]+，422，363[M-C6H11]+，345[M-C6H11-H2O]+(基峰)，327，269，69。1H-NMR(py-d5，600 MHz)δ：6.26(1H，d，J=2.4 Hz，H-7)，4.95(1H，br.s，H-28a)，4.85(1H，br.s，H-28b)，4.24(1H，br.s，H-3)，4.19(1H，br.d，H-2)，4.04(1H，dd，J=9.0，4.2 Hz，H-22)，2.95(1H，t，J=9.0 Hz，H-17)，2.61(2H，m，H-23)，2.41(1H，septed，J=6.6 Hz，H-25)，1.59(3H，s，Me-21)，1.22(3H，s，Me-18)，1.07(3H，s，Me-19)，1.03(3H，d，J=6.6 Hz，Me-26)，1.01(3H，d，J=6.6Hz，Me-27)；13C-NMR(py-d5，150 MHz)δ：17.9(C-18)，21.2(C-11)，21.5(C-21)，21.6(C-12)，21.9(C-27)，22.1(C-26)，24.5(C-19)，31.8(C-16)，32.1(C-15)，32.5(C-4)，33.7(C-25)，34.5(C-9)，38.0(C-1)，38.4(C-23)，38.8(C-10)，48.2(C-13)，50.0(C-17)，51.5(C-5)，68.1(C-3)，68.2(C-2)，75.4(C-22)，76.8(C-20)，84.2(C-14)，108.7(C-28)，121.7(C-7)，154.4(C-24)，166.2(C-8)，203.7(C-6)。以上数据与文献报道的猪苓酮B(polyporusterone B)基本一致[3]，为首次从猪苓菌丝体中分离获得。

化合物6：白色片状结晶(三氯甲烷-甲醇)。mp 65～66 ℃。1H-NMR(CDCl3，600 MHz)δ：4.24(2H，m，H-1′)，4.16(1H，dd，J=7.8，4.2 Hz，H-2)，2.69(1H，br.s，2-OH)，1.78(1H，m，H-3a)，1.63(1H，m，H-3b)，0.88(3H，t，J=7.2 Hz，Me-24)；13C-NMR(CDCl3，150 MHz)δ：175.5(C-1)，70.5(C-1′)，61.6(C-2)，34.5(C-3)，31.9(C-4)，29.7-29.6(亚甲基碳信号，重叠)，29.6(C-21)，29.5(C-22)，29.4(C-23)，29.3(C-24)。以上数据与文献报道的α-羟基二十四烷酸乙酯(α-hydroxytetracosanoic ethyl ester)基本一致[19]，为首次从猪苓菌丝体中分离获得。

化合物7：白色无定形粉末(三氯甲烷)。mp 141～142 ℃。EI-MSm/z：665[M-H2O]+。1H-NMR(py-d5，600 MHz)δ：8.57(1H，s，J=9.0 Hz，NH)，5.11(1H，ddd，J=9.0，4.8，4.8 Hz，H-2)，4.62(1H，dd，J=7.8，3.6 Hz，H-2′)，4.51(1H，dd，J=10.8，5.4 Hz，H-1b)，4.42(1H，dd，J=10.8，5.4 Hz，H-1a)，4.35(1H，dd，J=6.0，5.4Hz，H-3)，4.28(1H，m，H-4)，2.24(1H，m，H-5)，2.22(1H，m，H-3′b)，2.04(1H，m，H-3′a)，1.94(1H，m，H-5)，1.93(1H，m，H-6b)，1.71(1H，m，H-6a)，0.87(6H，m，18-CH3and 24-CH3)；13C-NMR(py-d5，150 MHz)δ：175.2(C-1′)，76.8(C-3)，73.0(C-4)，72.4(C-2′)，62.1(C-1)，53.0(C-2)，35.7(C-3′)，34.2(C-5)，26.6(C-6)，22.9(C-17)，14.3(C-18，C-24′)。以上数据与文献报道的N-(2′-羟基二十四烷酰)-1，3，4-三羟基-2-十八鞘氨[N-(2′-hydroxytetracosanoyl)-1，3，4-trihydroxyl-2-octodecanine]基本一致[20]，为首次从猪苓菌丝体中分离获得。

化合物8：白色粉末状固体(甲醇)。mp 226～227 ℃。EI-MSm/z：268[M+H]+，237[M-H2O]+，178，164，135(基峰)，108。1H-NMR(DMSO-d6，600 MHz)δ：8.35(1H，s，H-2)，8.14(1H，s，H-8)，7.37(2H，s，-NH2)，5.20(1H，d，J=4.6Hz，H-1′)，4.61(1H，dd，J=11.3，6.3Hz，H-4′)，4.14(1H，dd，J=7.6，4.6Hz，H-2′)，3.96(1H，dd，J=6.3，3.4Hz，H-3′)，3.67(1H，m，H-5′a)，3.55(1H，m，H-5′b)；13C-NMR(DMSO-d6，150 MHz)δ：156.1(C-6)，152.3(C-2)，149.0(C-4)，139.9(C-8)，119.3(C-5)，87.9(C-1′)，85.9(C-4′)，73.4(C-2′)，70.6(C-3′)，61.7(C-5′)。以上数据与文献报道的腺苷(adenosine)基本一致[21]，且与腺苷对照品混合熔点不下降，为首次从猪苓菌丝体中分离获得。

化合物9：无色针状结晶(水)。EI-MSm/z：123[M]+，106[M-NHCO]+，42[M-NHCO-HCN]+。1H-NMR(DMSO-d6，600 MHz)δ：13.45(1H，s，COOH)，9.07(1H，d，J=2.1 Hz，H-2)，8.80(1H，dd，J=4.8，1.6 Hz，H-6)，8.27(1H，m，H-4)，7.55(1H，m，H-5)。以上数据与文献报道的烟酸(nicotinic acid)基本一致[22]，为首次从猪苓菌丝体中分离获得。

化合物10：无色针状结晶(甲醇)。mp 186～187 ℃。EI-MSm/z：119[M+H]+，100[M-H2O]+，74[M-CO2]+，56，44。1H-NMR(DMSO-d6，600 MHz)δ：2.16(4H，m，H-2，3)。13C-NMR(DMSO-d6，150 MHz)δ：177.3(C-1，4)，29.8(C-2，3)。以上数据与文献报道的琥珀酸(succinic acid)基本一致[23]，为首次从猪苓菌丝体中分离获得。

化合物11：褐色无定形粉末状固体(三氯甲烷-甲醇)。mp>320 ℃。EI-MSm/z：112[M]+，69[M-NHCO]+。1H-NMR(DMSO-d6，600 MHz)δ：11.0(1H，s，NH-1)，10.79(1H，s，NH-3)，7.38(1H，dd，J=7.5，5.7 Hz，H-5)，5.44(1H，d，J=7.7 Hz，H-5)。以上数据与文献报道的尿嘧啶(uracil)基本一致[24]，且与尿嘧啶对照品混合熔点不下降，为首次从猪苓菌丝体中分离获得。

化合物12：白色粉末状固体(甲醇)。mp 166～167 ℃。Molish 反应呈阳性。EI-MSm/z：245[M+H]+，226，155，133，131，113(基峰)，73。1H-NMR(D2O，600 MHz)δ：11.3(1H，s，-NH)，7.88(1H，d，J=8.2 Hz，H-6)，5.78(1H，d，J=5.2 Hz，H-1′)，5.64(1H，d，J=8.0 Hz，H-5)，4.00(1H，m，H-4′)，3.95(1H，m，H-3′)，3.85(1H，m，H-2′)，3.61(1H，m，H-5′a)，3.54(1H，dd，J=12.2，2.4 Hz，H-5′b)；13C-NMR(D2O，150 MHz)δ：163.1(C-4)，150.7(C-2)，140.7(C-6)，101.8(C-5)，87.7(C-1′)，84.8(C-4′)，73.6(C-3′)，69.9(C-2′)，60.9(C-5′)。以上数据与文献报道的尿苷(uridine)基本一致[25]，为首次从猪苓菌丝体中分离获得。

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StudyonChemicalConstituentofMyceliumofPolyporusumbellatus(Pers.)Fries.

CHENXiaoMei，ZHOUWeiWei，WANGChunLan，GUOShunxing*

(InstituteofMedicinalPlantsDevelopment，ChineseAcademyofMedicalSciencesandPekingUnionMedicalCollege，Beijing100193，China)

Objective：To study the chemical constituents of mycelium ofPolyporusumbellatus(Pers)Fries.by liquid fermentation.MethodsLiquid fermentation was performed in 3 000 L fermentor.Mycelium ofP.umbellatuswas extracted by 95% ethanol.Chemical constituents were isolated and purified using silica gel and Sephadex LH-20 column.IR，MS and NMR spectral analysis were used to identify their structures.ResultsTwelve compounds were isolated from mycelium ofP.umbellatusand identified as：ergosterol(1)，ergosta-7，22-dien-3，5，6-triol(2)，ergosta-7，22-dien-3-one(3)，polyporusterone A(4)，polyporusterone B(5)，α-hydroxytetracosanoic ethyl ester(6)，N-(2′-hydroxytetracosanoyl)-1，3，4-trihydroxyl-2-octodecanine(7)，adenosine(8)，nicotinic acid(9)，succinic acid(10)，uracil(11)，and uridine(12).ConclusionCompounds1-12were isolated from mycelium ofP.umbellatusfor the first time.

Polyporusumbellatus；Mycelium；Chemical constituent；Steroids

国家自然科学基金(31201666)

*

郭顺星，研究员，博士生导师，研究方向：珍稀濒危药用植物菌根生物学；Tel：(010)62829619，E-mail：sxguo1986@163.com

10.13313/j.issn.1673-4890.2014.03.003

2013-11-18)