吸湿回干法提高冬凌草种子抗旱性的研究△

董诚明，乔毅琳，李明丹，李洋，冷慕婵，曹利华

(河南中医学院，河南 郑州 450046)

吸湿回干法提高冬凌草种子抗旱性的研究△

董诚明*，乔毅琳，李明丹，李洋，冷慕婵，曹利华

(河南中医学院，河南 郑州 450046)

目的采用PEG-6000溶液模拟干旱条件处理经过吸湿回干法锻炼的冬凌草种子，筛选出提高冬凌草种子抗旱性的方法。方法用PEG-6000溶液模拟干旱条件；用吸湿回干法对种子进行干旱锻炼；并分别采用考马斯亮蓝G-250染色法、愈创木酚法、硫代巴比妥法测其生理指标可溶性蛋白含量、过氧化物酶(POD)活性、丙二醛(MDA)活性。结果吸湿4 h干旱锻炼1次处理项的POD含量最高，吸湿1 h干旱锻炼2次次之，吸湿2 h干旱锻炼4次最低，并且吸湿1 h干旱锻炼2次、吸湿4 h干旱锻炼1次处理项的MDA含量均低于对照组，说明经过这两项的处理种子的生活力增强，即抗旱性增强。结论吸湿回干法可以提高冬凌草种子的发芽率，最好的处理项是吸湿4 h干旱锻炼1次。

冬凌草种子；PEG-6000溶液；抗旱性；可溶性蛋白；过氧化物酶；丙二醛；吸湿回干法

冬凌草Rabdosiarubescens(Hemsl.)Hara为唇形科Lamiaceae香茶菜属植物，以全株入药。冬凌草味甘苦，性微寒，具有清热解毒，消炎止痛，健胃活血及抗肿瘤之功效[1]。药用冬凌草主产于河南济源太行山、王屋山地区[2]。冬凌草多处于野生状态，太行山区石多土少，气候干燥，生长环境较差，因此产量很不稳定[3]。1991年我国卫生部批准将其干燥叶及地上部分作为中药材，收入部颁中药材标准，临床用药量很大，但是冬凌草种子的产量却不高，冬凌草种子抗旱性方面的研究也很少，然而仔细研究太行山区的气候条件不难发现干旱对冬凌草种子的生长及有效成分的含量高低有很大的影响。因此，通过科学的评价体系研究冬凌草种子的抗旱性是十分有必要的。

干旱锻炼是指将植物处于一种致死量以下的干旱条件中，让植物经受干旱磨炼，以提高其对干旱的适应能力，是农业生产中常用的并且经济有效的提高作物抗旱性的方法之一[4]。植物对干旱胁迫的适应过程和受伤害程度与干旱胁迫的强度以及植物自身的抗性紧密联系，并以生化代谢、生理功能、形态适应、生长发育以及生物生产力等多种形式表现出来[5]。因此种子的抗旱性与发芽后幼苗中各种保护酶及蛋白质的含量有一定的相关性。本课题通过测量比较各处理项中保护酶及蛋白质含量的变化，总结与冬凌草种子抗旱性相关的保护酶含量的变化规律，从而选出可以有效提高其发芽率的干旱锻炼方法。

1 仪器与试剂

光照培养箱(SPX-250-GB，上海跃进医疗器械厂)；紫外分光光度计(美谱达仪器 UV-3200S系列)；高速冷冻离心机(KDC-160HR，科大创新股份有限公司中佳分公司)。

PEG-6000(天津市科密欧化学试剂有限公司)；Tris(上海蓝季科技发展有限公司)；愈创木酚(天津市科密欧化学试剂开发中心)；2-硫代巴比妥酸(上海远帆助剂厂)；甘油；β-巯基乙醇(Amresco)；考马斯亮蓝G-250(中国医药集团上海化学试剂公司)；牛血清白蛋白(AD0023生工生物)。

2 材料与方法

实验材料为2012年采收的济源成熟冬凌草种子，经河南中医学院董诚明教授鉴定为唇形科香茶菜属植物冬凌草Rabdosiarubescens(Hemsl.)Hara的种子。

2.1 PEG-6000溶液模拟干旱条件处理冬凌草种子

精选成熟饱满冬凌草种子，经2%次氯酸钠消毒15 min，蒸馏水反复冲洗数次直至没有次氯酸钠溶液的味道为止，均匀平铺在直径为10 cm的培养皿内，水分胁迫条件由PEG-6000溶液产生，质量浓度分别为0%、5%、10%、15%、，放在温度(25±1) ℃的培养箱中培养，培养五天后测其发芽率、MDA、POD及可溶性蛋白含量。

2.2 吸湿回干法模拟干旱锻炼处理冬凌草种子

精选成熟饱满的冬凌草种子，用吸湿回干法对冬凌草种子进行干旱锻炼。以蒸馏水为介质进行浸种，并以吸湿时间1 h、2 h、3 h、4 h设置四个处理项，每个处理项设置5组(每组100粒)，第一组种子经一次充分吸胀后在室温下干燥至原重量作为一次干旱锻炼，第二组种子同法进行两次干旱锻炼，第三组和第四组以此类推进行三次、四次干旱锻炼。第五组种子作为空白对照不进行干旱锻炼。将上述处理项在温度(25±1) ℃的培养箱中培养，五天后测其发芽率。

2.3 种子经吸湿回干法处理后抗旱性的测试

选择2.2项下中发芽率最好的三个处理项，即吸湿1 h干旱锻炼2次、吸湿2 h干旱锻炼4次、吸湿4 h干旱锻炼1次的种子，分别用PEG-6000溶液0%、5%、10%对以上3组进行干旱胁迫处理，对照组为不经处理的种子。各处理项种子放在温度(25±1) ℃的培养箱中培养五天。

2.3.1 用考马斯亮蓝G-250染色法测量冬凌草幼苗中可溶性蛋白含量[6]

2.3.2用硫代巴比妥法测量冬凌草幼苗中MDA含量[7]

2.3.3用愈创木酚法测量冬凌草幼苗中POD含量[8]

3 结果

3.1 PEG-6000溶液模拟干旱条件对冬凌草种子的影响

通过对冬凌草幼苗的发芽率、可溶性蛋白质含量、MDA活性、POD活性的比较，综合各项因素选择5%及10% PEG-6000溶液作为干旱胁迫条件。见表1。

表1 不同浓度PEG-6000对冬凌草种子影响

3.2 吸湿回干法模拟干旱锻炼对冬凌草种子发芽率的影响

综合种子发芽率、吸湿时间、回干次数、操作可行性及简便程度等各项因素，选择发芽率较高的吸湿1 h干旱锻炼2次、吸湿2 h干旱锻炼4次、吸湿4 h干旱锻炼1次3个处理项，进行抗旱性测试，结果见表2。

表2 吸湿回干各处理项种子的发芽率

3.3 种子经吸湿回干法处理后抗旱性的测试结果

3.3.1 吸湿回干法与干旱模拟结合对冬凌草幼苗中可溶性蛋白含量的影响 吸湿回干实验中吸湿1 h、2 h、4 h 3个处理项可溶性蛋白的含量均随着PEG-6000溶液浓度的升高而增加；0 %、5 % PEG-6000溶液培养的冬凌草幼苗可溶性蛋白含量均比原始样品稍低，10 % PEG-6000溶液培养的冬凌草幼苗可溶性蛋白含量比原始样品高，结果见表3。

3.3.2 吸湿回干法与干旱模拟结合对冬凌草幼苗中MDA含量的影响 吸湿回干实验中吸湿1 h、2 h、4 h三个处理项中MDA含量均随着PEG-6000溶液浓度的升高而增加，对比PEG-6000溶液浓度可看出吸湿1 h、4 h处理项的冬凌草幼苗中MDA含量比吸湿2 h低，并且均比原始样品含量低，结果见表4。

3.3.3 吸湿回干法与干旱模拟结合对冬凌草幼苗中POD含量的影响 吸湿回干实验中吸湿1 h、2 h、4 h三个处理项中POD含量均随着PEG-6000溶液浓度的升高而增加，对比PEG-6000溶液浓度可看出5%、10 % PEG-6000溶液培养的冬凌草幼苗中吸湿1 h、4 h处理项下POD含量比5 %PEG-6000溶液高，结果见表5。

表3 吸湿回干法与模拟干旱结合对冬凌草幼苗中可溶性蛋白含量的影响

表4 吸湿回干法与模拟干旱结合对冬凌草幼苗中MDA含量的影响

表5 吸湿回干法与模拟干旱结合对冬凌草幼苗中POD含量的影响

4 讨论

冬凌草种子活力下降的原因与其生理生化指标的变化有关[6]，种子抗旱性的高低可以间接反映出种子活力的大小，即活力强的种子抗旱性高。冬凌草种子活力与可溶性蛋白含量，POD酶含量呈正相关，与MDA含量呈负相关，说明冬凌草中的抗旱性与可溶性蛋白含量，POD酶含量呈正相关，与MDA含量呈负相关。根据实验测得的各项指标的含量可知通过吸湿1 h干旱锻炼2次、吸湿4 h干旱锻炼1次的种子抗旱性相对较强。

本次实验在发芽率较高的3个处理项的各保护酶含量测定过程中，发现吸湿1 h干旱锻炼2次处理所得幼苗的根长，三个浓度项均是对照组的一倍左右，吸湿4 h干旱锻炼1次次之，但是依然比对照组长，吸湿2 h干旱锻炼4次处理项较对照组短，且须根极少；3个处理项在相同培养时间里吸湿4 h干旱锻炼1次的子叶长势明显优于其他两项。从而更有利的说明吸湿2 h干旱锻炼4次处理项对种子发芽时根系的生长有抑制作用，抗旱性相对较低，而吸湿1 h干旱锻炼2次、吸湿4 h干旱锻炼1次处理项的抗旱性比对照组增强。

[1] 郑虎占，董泽宏，佘靖.中国现代化研究与应用[M].北京学苑出版社，1997(2)：1632.

[2] 郑晓轲，董三丽，冯卫生.冬凌草的质量控制研究[J].中国实验方剂学杂志，2005，11(2)：10-13.

[3] 陈随清，董诚明，冯卫生.太行山区冬凌草生态环境及生物学特性研究[J].中国野生植物资源.2005，24(4)：33-35.

[4] 谭晓荣，伏毅，戴媛，等.干旱锻炼提高小麦幼苗抗旱性的抗氧化机理研究[J].作物杂志，2009，(5)：19-23.

[5] 李忠光，龚明.愈创木酚法测定植物过氧化物酶活性的改进[J].植物生理学通讯.2008，44(2)：323-324.

[6] 李娟，张耀庭，曾伟，等.应用考马斯亮蓝法测定总蛋白含量[J].中国生物制品学杂志，2000，13(2)：118-120.

[7] 刘仲奇，胡永芳.脂质过氧化物——丙二醛的简便测定[J].甘肃中医学院学报，2001，18(3)：13-14.

[8] 张玉荣，刘通，周显青.影响愈创木酚法测定玉米过氧化物酶活力的因素[J].粮油加工，2008，(3)：94-97.

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ResearchonEnhancementofRabdosiarubescensSeedbyHydration-dyhydration

DONGChengming*，QIAOYilin，LIMingdan，LIYang，LENGMuchan，CAOLihua

(HenanUniversityofTraditionalChineseMedicine,Zhengzhou450046,China)

Objective：Using drought conditions in PEG-6000 solution to treatmentRabdosiarubescensseed after moisture to dry the exercise，screening the method to improve the drought resistance ofRabdosiarubescens.MethodsUse PEG-6000 solution simulate drought conditions；use the method of drought exercise on seed moisture ；And respectively by Coomassie brilliant blue G 250，guaiacol method，thiobarbituric acid method to measure the content of soluble protein，physiological index of peroxidase(POD)activity，malondialdehyde(MDA)activity.ResultsThe item of hygroscopic 4 h drought exercise 1 times was the highest in POD content，the item of hygroscopic 1 h drought exercise 2 times lower，the item of hygroscopic 2 h drought exercise 4 times was the minimum.And the items of hygroscopic 1 h drought exercise 2 times，hygroscopic 4 h drought 1 times were lower than the control group in MDA content treatment，suggesting that life force of seeds was enhanced after treatment of these two items，that is drought resistance of seeds was improved.ConclusionThe method of hydration-dyhydration can improve the germination rate ofRabdosiarubescensseed，the best processing item is hygroscopic 4 h exercise 1 times treatment.

Rabdosiarubescensseed；PEG-6000 simulation；Drought resistance；Soluble protein；Peroxidase；Malondialdehyde；Hydration-dyhydration

国家自然科学基金(81173486)；国家重大科技专项(2012ZX09304006)

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董诚明，教授，研究方向：中药资源开发利用；Tel：(0371)86535313 ，E-mail：dcm663@sina.com

10.13313/j.issn.1673-4890.2014.03.010

2013-07-18)